人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells，hESCs)具有自我复制及多潜能分化的能力，在体外适宜培养条件下可定向分化成特定的终末细胞，因此，胚胎干细胞最终可用于细胞移植治疗替代器官移植。目前，有关人胚胎干细胞定向诱导分化的方法已成熟有效，在体外可将胚胎干细胞定向诱导分化为神经元、心肌细胞、上皮细胞、造血前体细胞、角化细胞、成骨细胞及肝细胞等。相对日趋匮乏的移植器官，胚胎干细胞在体外可以无限增殖，提供源源不断的供体细胞，因此人胚胎干细胞有望成为细胞移植治疗的理想“种子细胞”。然而，无论是器官移植还是细胞移植治疗，免疫排斥反应是临床需要解决的首要问题，同样也是人胚胎干细胞用于临床治疗组织器官退行型病变需要考虑的问题。为了避免移植物与宿主之间的免疫排斥反应，再生医学的一个攻克目标是建立与宿主同基因的细胞。而获得这种细胞可以通过下述途径：在成体细胞上进行核移植建立多能干细胞，或通过转录因子对成体细胞重编程成为多潜能细胞，或对胚胎干细胞进行基因修饰。针对不同患者的特异性，最理想的治疗方案是设计一株能够逃逸机体免疫系统监控的万能细胞。　　 人类白细胞抗原G(Human Leucocyte Antigen G，HLA-G)属于非经典的MHCⅠ类分子，和其他的MHCⅠ类蛋白一样是由膜结合的重链与九聚肽以非共价键组成的复合物。不同与经典的MHCⅠ类分子，HLA-G呈现出低多态性和局限性分布的特点。HLA-G最早是从妊娠胎盘组织中克隆而来，主要表达在胎盘滋养细胞、蜕膜细胞。HLA-G这种特殊的局限性组织分布特性提示其可能与妊娠期间母胎免疫耐受作用有关。目前，许多学者已公认HLA-G在母胎免疫耐受、器官移植耐受及肿瘤免疫逃逸等方面发挥重要作用。基于以上提出的观点，本课题设计将HLA-G1稳定表达在人胚胎干细胞，验证稳定表达HLA-G1的人胚胎干细胞具有生物学功能，并提出稳定表达HLA-G1的人胚胎干细胞及其诱导分化细胞在移植过程具有免疫耐受功能这一假说。本课题就以上提出的观点，为解决细胞移植可能出现的移植物与受体之间出现的免疫排斥进行了如下尝试：　　 以慢病毒整合到宿主基因组的方法，将外源性基因HLA-G1表达在人胚胎干细胞中，富集稳定表达HLA-G1的人胚胎干细胞。HLA-G1+hES细胞在形态上与正常hES细胞无明显差别均呈克隆性生长，HLA-G1与正常hES细胞特异性的转录因子Oct4和Sox2共同表达于HLA-G1+hES细胞上。通过体内SCID小鼠成瘤实验，发现HLA-G1+hES能够形成包含三胚层的畸胎瘤，其出瘤时间、成瘤效率和瘤重与正常的hES细胞相比无差别(P>0.05)。实验初步表明HLA-G1并不影响hES细胞的多能性，致瘤性与普通hES细胞相似，随着hES细胞的分化，HLA-G1仍然能够持续表达。　　 以间质细胞衍生的诱导功能(stromal-derived inducing activity，SDIC)法替代经典的拟胚胎诱导法将hES细胞在体外定向诱导分化为神经外胚层多巴胺能神经元(Dopaminergic，DA)细胞。参考已发表文献中SDIC诱导分化法并将其进行改进，即：自诱导分化中期开始加入促分化因子SHH、FGF-8，改良后的SDIC共培养法可提高hES细胞的分化效率，分化10-12天即可检测出表达酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性的多巴胺能神经元细胞。用高效液相色谱分析法检测HLA-G1+hES细胞诱导分化的DA神经元，在经K+去极化后可分泌多种儿茶酚胺类神经递质，具有生物活性。ELISA法同样检测出在经K+去极化后的培养上清液中含有多巴胺神经递质。同时还追踪HLA-G1+hES细胞在不同分化时期均持续表达HLA-G1。　　 分别将HLA-G1+hES细胞、免疫共沉淀法富集得到的HLA-G1纯化蛋白、HLA-G1+hES诱导分化DA神经元细胞与T淋巴细胞反应，观察到上述三种HLA-G1表现形式均可明显抑制T淋巴细胞增殖。由于机体存在血-脑屏障，外周血T淋巴细胞难以通过血脑屏障到达中枢神经系统，而小胶质细胞在中枢神经系统发挥吞噬、清除异物的免疫作用。本实验将HLA-G1+hES细胞诱导分化DA神经元细胞与小胶质细胞(BV2)共培养，发现HLA-G1不仅能够抑制BV2细胞的增殖，还能显著抑制BV2细胞分泌IL-1β、IFN-γ炎性因子。　　 用人晶芯片高通量筛查HLA-G1+hES细胞基因表达情况，结果显示HLA-G1可差异性调节425个基因(比率>2.0或<0.5)，上调203个基因、降调222个基因。在所有差异性调节的基因中，参与分子粘附途径、肿瘤生长因子-β信号途径及免疫应答的基因占主导。HLA-G1可差异性调节7种免疫相关基因，正是这种协同效应能够解释HLA-G1+hES细胞具有免疫抑制效应。　　 本课题以慢病毒整合到宿主基因组的方法对hES细胞进行基因修饰，将外源基因HLA-G1表达在hES细胞中，得到一株稳定表达HLA-G1的人胚胎干细胞。HLA-G1+hES细胞在形态上与正常hES细胞无明显差别均呈克隆性生长，HLA-G1能够与正常hES细胞特异性的转录因子Oct4和Sox2共同表达于HLA-G1+hES细胞上，而且通过体内SCID小鼠成瘤实验，发现HLA-G1+hES能够形成包含三胚层的畸胎瘤。实验初步表明HLA-G1不影响hES细胞的多能性，随着hES细胞的分化，HLA-G1仍然能够持续表达。稳定表达HLA-G1的hES及由此来源的分化终末细胞均具有免疫抑制作用，HLA-G1以三种不同的表现形式，在体外均可抑制T细胞的增殖，减少小胶质细胞释放炎性因子IL-1β、IFN-γ。无论是HLA-G1+hES还是由此分化的终末细胞均有免疫抑制活性，因此，HLA-G1+hES细胞有望成为细胞移植的“通用种子细胞”，能够减少宿主对移植物的排异反应，为细胞移植治疗提供新的思路。