脑缺血是由于脑组织不能得到充分的血液供应从而无法维持正常的神经功能而引起的一种疾病。因为脑组织的本身几乎无能量储备,脑组织正常生理功能和生命活动的维持,需要有充足的血液供应氧和葡萄糖。脑动脉在运输血流供应脑能量方面发挥重要作用,血管功能障碍是导致脑缺血发生的的重要因素。血管平滑肌是缺氧作用的潜在靶点。研究发现氧分压降低可通过改变细胞内的Ca²⁺水平而使肺动脉收缩。近来,Na⁺, K⁺-ATP酶在缺氧中作用也越来越被重视。Na⁺, K⁺-ATP酶是维持细胞基本生理功能的关键酶。其可利用ATP释放的能量将细胞内Na⁺运输到胞外,同时将细胞外的K⁺运到胞内,从而维持细胞内外的Na⁺、K⁺浓度梯度,保持细胞的膜电位和兴奋性。脑缺血、缺氧时,ATP生成减少,细胞能量代谢障碍,Na⁺, K⁺-ATP酶活性降低,细胞内Na⁺浓度升高,Na⁺-Ca2⁺交换增强,引起细胞内钙超载,最终导致细胞发生不可逆的损伤。因此Na⁺, K⁺-ATP酶功能改变引起细胞损伤在脑缺血发生发展过程中发挥重要作用。目前对于血管平滑肌上Na⁺, K⁺-ATP酶的研究多集中在肺动脉上,而对于脑血管平滑肌Na⁺, K⁺-ATP酶在缺氧过程中作用的研究尚未见报道。因此,本实验选取大鼠脑基底动脉,以及基底动脉平滑肌细胞作为研究对象,探讨缺氧条件下脑血管平滑肌Na⁺, K⁺-ATP酶变化及其作用机制,旨在进一步揭示Na⁺, K⁺-ATP酶在缺血、缺氧性脑病发生发展中的作用。一、缺氧对大鼠离体基底动脉环收缩的影响目的:研究缺氧对大鼠基底动脉收缩的影响。方法:采用微血管张力测定仪记录大鼠（内皮完整和去除内皮）离体基底动脉环在正常和缺氧状态下变化,以及给予钙通道阻断剂后的张力改变。采用激光共聚焦显微镜检测平滑肌细胞内Ca²⁺的变化。结果:（1）缺氧对KCl预收缩基底动脉作用的影响在常氧状态下,无论内皮是否存在,KCl均能引起稳定的血管收缩。且在缺氧状态下,去内皮及内皮完整的基底动脉对KCl收缩反应均明显增强,缺氧10min达到高峰。此后随着缺氧时间的延长,基底动脉收缩力不再进一步升高（2）缺氧对基底动脉KCl量效曲线的影响在内皮完整的基底动脉环,缺氧可使KCl量效曲线明显左移。与正常对照组相比,除10mmol/L和20mmol/L外,缺氧后40mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L和100mmol/L KCl产生的血管收缩力依次为:0.090±0.039、0.421±0.082、0.545±0.121、0.620±0.141、0.680±0.151和0.731±0.162 mN/mm。均明显高于正常对照组相应浓度KCl产生的血管收缩力:0.042±0.034、0.198±0.088、0.265±0.082、0.327±0.081、0.383±0.077和0.432±0.069 mN/mm（p<0.01）缺氧也可使去内皮基底动脉的KCl量效曲线明显左移。与正常对照组相比,缺氧后最大收缩反应Emax明显增高（从0.392±0.052mN/m到0.773±0.106 mN/mm）,pD2也从1.23±0.05增加到1.32±0.03（p<0.01）。表明缺氧可使基底动脉对KCl的反应性明显增强（3）缺氧对U46619预收缩去内皮基底动脉作用的影响去除内皮的基底动脉在缺氧状态下对U46619收缩反应与正常对照组相比明显增强,缺氧5min达到高峰。随着缺氧时间的延长,收缩虽有所下降,但仍明显强于对照组（4）缺氧对去内皮基底动脉U46619量效曲线的影响缺氧可使U46619收缩基底动脉的量效曲线明显左移。与正常对照组相比,除10-10mol/L和10-9mol/L外,缺氧后10-8mol/L、10-7mol/L、5×10-7mol/L、10-6mol/L U46619产生的血管收缩力依次为:0.106±0.018、0.248±0.042、0.620±0.108、和0.670±0.084 mN/mm。均明显高于正常对照组相应浓度U46619产生的血管收缩力:0.060±0.024、0.102±0.012、0.312±0.070、和0.340±0.076 mN/mm（p<0.01）。且缺氧后pD2也明显升高从6.27±0.82增加到6.76±0.07（p<0.01）。（5）尼莫地平对基底动脉缺氧性收缩的作用在内皮完整的血管环上,60mmol/L KCl预收缩血管产生的收缩幅度为:0.18±0.065mN/mm,缺氧后升高到0.38±0.06mN/mm。预处理10-8M的尼莫地平30min可降低缺氧性收缩,至0.31±0.10mN/mm。在去内皮血管环,给予KCl后血管收缩力为0.26±0.05mN/mm,缺氧后升至0.54±0.05mN/mm,给予10-8M的尼莫地平预处理,缺氧后的收缩幅度降为0.32±0.11mN/mm。但在常氧状态下,尼莫地平对KCl引起的收缩没有明显抑制作用,内皮完整血管环和去内皮血管环加入尼莫地平后收缩幅度分别为:0.16±0.05mN/mm,及0.217±0.06mN/mm,与未加入尼莫地平之前相比,无明显变化。（6） Ryanodine对基底动脉的缺氧性收缩的作用缺氧可使KCl预收缩的基底动脉环的收缩明显升高,去内皮的血管环从0.19±0.010mN/mm升到0.54±0.049mN/mm,内皮完整的血管环从0.19±0.043mN/mm升到0.38±0.061mN/mm。在这两种血管环上10-5MRyanodine均能明显抑制这种缺氧性收缩（p<0.01）,其中在内皮完整血管环可降低其缺氧性收缩至0.25±0.066mN/mm,在去内皮血管环降至0.30±0.083mN/mm。而10-5MRyanodine对KCl常氧状态下引起的收缩无明显作用。（7） Ni2+对基底动脉的缺氧性收缩的作用在内皮完整及去内皮血管环,10-3mol/LNi2+均可抑制其缺氧性收缩（内皮完整:0.38±0.06→0.23±0.07 mN/mm;去内皮:0.54±0.05→0.23±0.08 mN/mm）。而在常氧状态下,对KCl引起的收缩没有抑制作用（内皮完整:0.19±0.04→0.19±0.07 mN/mm;去内皮:0.19±0.01→0.18±0.13 mN/mm）（8）缺氧对[Ca2+]i的影响①培养大鼠基底动脉平滑肌细胞形态学观察原代培养细胞接种第3天镜下可见少量细胞贴壁,第5天贴壁细胞明显增多,可出现VSMC特有的“峰谷”特征。对VSMCα-肌动蛋白进行免疫细胞化学染色,高倍镜下可见大量呈棕黄色、与细胞长轴平行的肌丝,即α-肌动蛋白②灌流缺氧对平滑肌[Ca2+]i的影响常氧状态下平滑肌细胞[Ca2+]i荧光强度为:39.8±6.5,无氧灌流20min后[Ca2+]i荧光强度明显升高（66.4±13.8, p<0.01）。③缺氧培养对平滑肌[Ca2+]i的影响缺氧3h后[Ca2+]i开始增高（P<0.05）12h升到最高。此后随着缺氧时间的延长,[Ca2+]i不再进一步升高。表明缺氧可使细胞损伤,造成细胞内钙超载结论:在内皮完整和去内皮的基底动脉上,缺氧均可引起其收缩明显增强。尼莫地平、Ryanodine以及Na+-Ca2+交换抑制剂Ni2+均能明显降低基底动脉的缺氧性收缩。缺氧可导致平滑肌细胞内Ca2+升高。二、缺氧对基底动脉Na+, K+-ATP酶的影响目的:研究缺氧对基底动脉平滑肌细胞Na+, K+-ATP酶的影响。方法:双酶法检测Na+, K+-ATPase活性,RT-PCR方法检测α各亚基mRNA的变化;Western blot检测α亚基蛋白表达的变化;免疫荧光检测α各亚基表达的变化,全细胞膜片钳记录钠泵电流的改变。结果:（1）缺氧对Na+,K+-ATP酶活性的影响①缺氧对基底动脉Na+,K+-ATP酶活性的影响实验表明:随着缺氧时间的延长,Na+,K+-ATP酶活性逐渐降低,缺氧0min、2min、5min、10min、15min、20min的Na+,K+-ATP酶活性依次为:33.0±5.4、31.0±6.2、26.0±5.2、17.0±3.4、20.0±3.7和20.6±3.6μmolPi/mg protein/h。缺氧10min时Na+,K+-ATP酶的活性降到最低（p<0.01）。②缺氧对平滑肌细胞Na+,K+-ATP酶活性的影响正常血管平滑肌细胞Na+, K+-ATP酶活性为52.72±8.69μmol NADH/mg protein/h,缺氧后酶的活性明显降低,3h降为36.86±7.35μmol NADH/mg protein/h P<0.01),缺氧6h降到最低22.67±8.38μmol NADH/mg protein/h（P<0.01）,之后随着缺氧时间的延长,酶的活性虽然进一步降低,但与6h相比,无明显差异。③缺氧对基底动脉平滑肌细胞钠泵电流的影响正常状态下细胞灌流ouabain 10-3mol/L后,钠泵电流密度为0.177±0.0257 pA/pF,缺氧24h后钠泵电流密度降为0.101±0.0217 pA/pF,与缺氧前相比有明显差异（P<0.01）;电流电压关系曲线测定结果也表明,缺氧后在不同电压下的钠泵电流的电流密度均较缺秧前明显降低,提示缺氧降低Na+,K+-ATP酶的功能。（2）缺氧对基底动脉平滑肌细胞Na+,K+-ATP酶α亚基mRNA表达的影响缺氧后24h,α1亚基mRNA水平开始降低（P<0.05）,α2亚基mRNA水平在缺氧12h明显降低（P<0.01）,α3亚基mRNA表达对缺氧不敏感,无显著性变化。（3）缺氧对基底动脉平滑肌细胞Na+,K+-ATP酶α亚基蛋白表达的影响缺氧后α1亚基蛋白表达无明显变化;在缺氧12h时,α2亚基蛋白表达明显降低（P<0.01）,但在48h后又逐渐回升至正常对照水平。（4）缺氧对基底动脉平滑肌细胞Na+,K+-ATP酶α亚基分布的影响缺氧24h后α1、α2、α3三个亚基的荧光强度与正常对照组相比无显著差异（P>0.05）。正常状态下,α1多均匀分布在细胞外膜以及核膜上,胞浆内含量较少;α2多分布在细胞表面和胞浆内;α3主要位于胞浆内,且成簇状分布。缺氧24h后α1、α2、α3的表达位置无明显改变。结论:随着缺氧时间的延长,Na+,K+-ATP酶活性逐渐降低,呈时间依赖性。缺氧24h钠泵电流密度明显降低。缺氧后24hα1的mRNA表达降低,但蛋白表达并未发生明显变化;α2在缺氧12h后mRNA和蛋白表达均明显降低;α3亚基的mRNA在缺氧后无明显变化。α各亚基的在细胞内的表达在缺氧前后并无明显变化。三、Na+, K+-ATP酶参与大鼠离体基底动脉环缺氧性收缩目的:研究Na+,K+-ATP酶在大鼠基底动脉缺氧性收缩过程中作用及机制。方法:采用微血管张力测定仪记录给予ouabain和无钾液预处理后离体基底动脉环缺氧后收缩力变化以及缺氧前后ouabain量效曲线。无机磷法检测Na+, K+-ATPase活性。激光共聚焦显微镜技术检测[Ca2+]i.。结果:（1）ouabain对缺氧增强KCl预收缩基底动脉作用的影响对内皮完整的基底动脉环,预先孵育ouabain5×10-7 mol/L 30min后对缺氧所致的血管收缩增强无明显影响。而在去内皮的基底动脉,ouabain孵育30min可明显降低缺氧对KCl预收缩血管环的增强作用。ouabain本身对KCl引起的血管反应无明显作用。（2）ouabain对缺氧前后KCl收缩基底动脉量效曲线的影响在内皮完整的基底动脉环,无论有无ouabian存在,缺氧均可使KCl量效曲线明显左移。ouabain5×10-7 mol/L除在缺氧情况下可明显增高pD2（p<0.01）外,其对缺氧情况下的最大收缩反应Emax以及在常氧条件下的KCl量效曲线均无影响。缺氧也可使去内皮基底动脉的KCl量效曲线明显左移。与正常对照组相比,缺氧后最大收缩反应Emax明显增高（从0.392±0.052mN/m到0.773±0.106 mN/mm）,pD2也从1.23±0.05增加到1.32±0.03（p<0.01）。ouabain5×10-7 mol/L预处理可明显降低缺氧所致的Emax和pD2升高（p<0.05）,使量效曲线右移。（3）ouabain及无钾液对缺氧增强U46619收缩去内皮基底动脉作用的影响去除内皮的基底动脉在缺氧状态下对U46619收缩反应与正常对照组相比明显增强。ouabain5×10-7 mol/L预处理或无钾液均能降低这种缺氧性收缩,但不能完全抑制。（4）ouabain及无钾液对缺氧前后U46619收缩去内皮基底动脉量效曲线的影响缺氧可使U46619收缩基底动脉的量效曲线明显左移。缺氧后10-8mol/L、10-7mol/L、5×10-7mol/L、10-6mol/L U46619产生的血管收缩力依次为:0.106±0.018、0.248±0.042、0.620±0.108、和0.670±0.084 mN/mm。ouabain5×10-7 mol/L预处理血管缺氧后的收缩力降至:0.085±0.019、0.143±0.031、0.463±0.103、0.513±0.085 mN/mm。无钾液也能降低这种缺氧性收缩,使血管缺氧后的收缩力降至:0.083±0.022、0.160±0.027、0.444±0.091、0.503±0.077 mN/mm。在常氧状态下, ouabain或无钾液对U46619所致基底动脉收缩无明显影响,但在缺氧状态下,ouabain 5×10-7 mol/L或无钾液均能降低U46619收缩基底动脉的pD2（p<0.05）。（5）缺氧对ouabain量效曲线的影响无论内皮是否存在,也无论在正常或缺氧情况下,ouabain均能浓度依赖性收缩大鼠基底动脉,且其量效关系曲线可经两点结合模型进行最佳拟合。拟合结果提示,大鼠基底动脉存在两种功能不同的钠泵,即高亲和力钠泵和低亲和力钠泵。与正常对照组相比,无论内皮是否存在,缺氧后ouabain量效曲线均右移。缺氧可明显降低血管环高亲和力α亚基构成比例fh（内皮完整:62.0%→46.6%;去内皮:48.4%→8.8%）,而增加低亲和力α亚基构成比例fL（内皮完整:38.0%→53.4%;去内皮:51.6%→91.2%）。（6）ouabain对平滑肌[Ca2+]i的影响5×10-7mol/L ouabain灌流后,平滑肌[Ca2+]i荧光强度明显升高（38.9±6.2→47.0±7.6,p<0.01）,而用含ouabain无氧的液体继续灌流细胞后,[Ca2+]i荧光强度进一步升高至56.7±10.5（p<0.01）。采用单纯无氧的液体灌流细胞后[Ca2+]i荧光强度与预处理ouabain后无氧灌流组相比,明显升高（p<0.01）。（7）ouabain对基底动脉Na+,K+-ATP酶活性的影响ouabain 5×10-7 mol/L可使Na+, K+-ATP酶活性明显降低（p<0.01）。而预先孵育ouabain后再缺氧,也可显著降低Na+, K+-ATP酶活性（p<0.01）,其降低幅度与单纯缺氧10min或ouabain 5×10-7 mol/L的降低幅度相比无显著差异（p>0.05）,提示缺氧10min可完全抑制本研究所用基底动脉的Na+, K+-ATP酶活性。结论:ouabain和无钾液均可降低去除内皮的基底动脉的缺氧性收缩,缺氧使ouabain量效曲线右移,且降低基底动脉高亲和力亚基的构成比例。提示Na+, K+-ATP酶高亲和力α2亚基参与了基底动脉缺氧性收缩。