1993年,WHO宣布―全球结核紧急状态‖,至今结核病仍是全球面临的最严重传染病威胁。WHO结核病全球报告显示:2014年,结核病使89万名男性、48万名女性和14万名儿童死亡。2000年以来全球结核病发病率每年下降1.5%,总共降低了18%。估计2014年全球新发48万耐多药(Multidrug resistant,MDR)结核,其中仅约26%病例得到检测和报告。尽管结核病控制已取得了明显进步,但进展还远不够,特别是耐药结核检测、治疗上存在巨大的缺口。有报道对耐药性结核进行了全国范围的调研,发现在3037例初诊结核患者和892例已经治疗的患者中,分别有5.7%和25.6%的患者为耐药结核。约有四分之一对异烟肼/利福平或两者均产生耐药性,约8%的MDR结核患者为广泛耐药(Extensivedrugresistant,XDR)结核。结核耐药已成为全球范围内急需解决的科学问题和社会问题,在标准化疗方案的可靠性下降、研发抗结核新药无显著进展的背景下,推广药敏试验指导下的个体化化疗方案势在必行。控制耐药结核的关键在于合理使用敏感药物,但WHO报告仅3%的耐药结核患者得到了准确有效的治疗。因此,应尽早诊断结核耐药、及时进行药敏指导下的个体化治疗,以降低获得性结核耐药的发生和原发性结核耐药的传播。常规结核药敏试验方法结果可靠,但耗时2-3个月,期间耐药结核患者无法得到有效治疗。因此快速准确的分子药敏检测方法成为结核病耐药检测领域的研究热点。目前,我国绝大部分医院因为实验室条件限制,对于结核耐药检测结果需从当地结核病专科医院获取。专科医院一般首先基于结核分枝杆菌快速培养系统进行细菌培养,再通过改良罗氏绝对浓度法进行药敏检测获取药敏结果。因其培养阳性率低、实验检测总耗时长(一般30-60天),严重影响结核病的个体化诊疗。一些骨关节结核患者术后进行经验性4联药物化疗,在取得药敏结果之前就已复发。随着结核耐药基因研究的不断深入,研发能应用于广大综合临床医院的快速、准确的结核药敏分子检测技术已成为焦点。基因芯片是一种二代测序技术。它作为一个集成的分析设备,因可在载体上固定的成千上万的官能化探针,对目标样本进行准确、快速、高吞吐量的并行分析,而早已在生物化学和医学诊断领域进行应用。对于具有众多基因位点突变导致不同药物耐药的结核分枝杆菌而言,生物芯片技术对其进行快速药敏检测具有技术可行性和高通量优势。用基因芯片进行结核耐药检测可直接在综合性医院检验实验室完成,并且随着基因芯片技术的不断发展和成熟,制造及检测成本不断下降,其已广泛应用的条件可行性。生物芯片北京工程研究中心研发的国内第一款结核快速药敏检测产品―晶芯?结核分枝杆菌耐药检测试剂盒‖,能同时检测利福平和异烟肼两种一线药物的耐药检测,并具有很高的灵敏度和特异度。因此,本项目与生物芯片北京工程研究中心合作研发出基于tagarray平台的第二代结核分枝杆菌耐药检测芯片(tagarray芯片),同时对8个耐药基因,22个突变位点,38种突变型进行分析,检测结核杆菌对rfp/inh/emb/sm/slid(amk、cpm、km)/fqs等一、二线药物的耐药情况。因此,本课题基于生物芯片北京工程研究中心的arms-pcr-磁珠tagarray平台研发tagarray结核耐药基因检测芯片系统,主要分为两部分:(1)对不同模板浓度的质粒进行检测,了解新型结核耐药检测芯片检测灵敏度和特异度;(2)在此基础上,运用二代芯片对骨关节结核临床分离株进行耐药基因检测,与结核表型耐药结果对比分析,评价其特异性、灵敏度、准确性和可行性。方法:1、在北京疾控中心获取已进行测序的不同突变型的结核杆菌菌株并进行质粒提取(每个菌株样本只含有一种突变型)共24株。获取质粒后进行浓度检测,并将不同质粒分别稀释成1×103拷贝/μl、1×103拷贝/μl、1×104拷贝/μl、1×105拷贝/μl、1×106拷贝/μl,然后进行多重pcr扩增并行芯片杂交,分析该芯片检测系统对样本检测的灵敏度和特异度,评估其在临床实际检测的可行性及应用前景。2、从重庆市公共医疗卫生救治中心获取从骨关节结核患者提取的临床分离株样本187株,其中敏感菌50株,各种类型耐药菌137株(均含有药敏和测序结果)。设计、优化和制备芯片检测体系,包括引物与标签筛选,多重pcr扩增体系的构建和优化,杂交体系优化。然后用二代芯片对187株结核分枝杆菌临床分离株进行药敏检测,对照测序结果和表型药敏结果进行分析灵敏度、特异度。结果:1、用基因芯片对24种不同突变型的菌株进行检测,在模板浓度为1×103拷贝/μl及以上的组均显示出与测序结果一致的突变型,在模板浓度为1×102拷贝/μl的组有29组出现了假阴性结果。2、在126株利福平表型耐药株中,芯片检测出119株在rpob基因出现突变,另有7株未检测出rpob基因突变;在利福平表型敏感株中,检测出9株rpob基因耐药位点突变。与表型药敏结果比较,芯片检测敏感度为:94.40%;特异度为:86.76%。118株异烟肼表型耐药株中,芯片检测出109株耐药株有相关耐药基因位点突变,另有9株表型耐药株未检测出耐药基因位点突变;与表型药敏结果比较,芯片检测敏感度为:92.37%;特异度为:81.16%。44株乙胺丁醇表型耐药株中,芯片检测出27株在embB306位点上有突变,另有17株表型耐药株中未检测到该耐药位点突变;在乙胺丁醇表型敏感株中,有6株检测到embB306位点突变。与表型药敏结果比较,芯片检测敏感度为:61.36%;特异度为:95.80%。102株喹诺酮类药物表型耐药株中,芯片检测出81株在gyr A基因上有突变,另有21株表型耐药株中未检测到相关基因位点突变;在敏感株中有4株检测到gyrA基因突变。与表型药敏结果比较,芯片检测敏感度为:79.41%;特异度为:95.29%。112株链霉素表型耐药株中,芯片检测出101株在相关耐药基因位点上有突变,另有12株表型耐药株未检测出耐药基因位点突变;与表型药敏结果比较,芯片检测敏感度为:90.17%;特异度为:84.00%。SLID(阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素)具有交叉耐药性,在67株表型耐药株中,芯片检测出52株在相关耐药基因位点上有突变,另有15株表型耐药株未检测出耐药基因位点突变;在表型敏感株中,有11株检测出rrs1401基因突变。其敏感度为:77.61%,特异度为87.50%。结论:1、通过质粒检测,Tag Array芯片能够在模板浓度不低于1×103拷贝/μl的条件下进行快速、准确的耐药检测。临床上大部分样本能满足其检测条件,而个别情况下需要进行结核杆菌培养后再进行检测。本芯片检测的样本的灵敏度较高,具有临床应用的可行性2、与表型耐药相比,Tag Array芯片检测RFP、INH、FQS、SM耐药基因具有较高的而敏感度和特异度。SLID(AMK、CPM、KM)特异度较高,但敏感度较低。可在检测时增加eis启动子区的突变检测,提高其敏感度。EMB耐药基因检测敏感度较低,易引起EMB耐药漏诊,但其特异性较高,因此阳性结果对于早期制定个体化方案有重要参考价值。通过Tag Array结核耐药基因检测芯片可实现结核耐药快速、准确、高通量检测,具有重要的临床意义及可行性。