论文部分内容阅读
哺乳动物不育系20样激酶1/2(MST1/2)是果蝇hippo基因在哺乳类动物中的同源基因MST1/2编码的蛋白,也是哺乳动物中Hippo信号通路的核心组分,具有调节器官大小、影响细胞增殖、凋亡及抑制肿瘤生长等功能。本实验从分子、细胞及动物水平上探讨MST1在结直肠癌中的作用及分子机制,旨在为结直肠癌的治疗提供新的潜在靶点。方法:1、质粒的双酶切鉴定、纯化及扩增感受态细胞扩增及AgeI和EcoRI双酶切鉴定质粒p-EGFP-MST1和p-EGFP-N1。鉴定后进行大量扩增、纯化及浓度的测定。2、不同浓度、时间5-FU对SW480细胞增殖及MST1、Phospho-YAP1(Ser127)、PUMA等蛋白的影响不同浓度梯度、时间的5-FU处理SW480细胞,MTS比色法检测细胞增殖抑制率,Western blot检测不同浓度5-FU对MST1、YAP、Phospho-YAP1(Ser127)、p73、p53、PUMA和caspase-3蛋白表达的影响。3、MST1对SW480细胞作用的体外实验研究Western blot和RT-qPCR检测3个siRNA干扰片段对SW480细胞MST1的沉默效率,筛选沉默效率高的片段。体外DNA转染试剂转染siRNA或p-EGFP-MST1至细胞或与5-FU共同处理SW480细胞,MTS比色法、流式细胞术及Hoechst 33342染色法检测高表达和沉默MST1对细胞增殖与凋亡的影响;RT-qPCR检测MST1、yap、p73、p53、caspase3、CTGF和AREG的m RNA的转录水平,Western blot方法检测MST1、YAP、Phospho-YAP1(Ser127)、p73、p53、PUMA和caspase-3蛋白表达情况,初步探讨MST1在体外对SW480增殖及凋亡影响的分子机制及MST1表达与5-FU促进细胞凋亡的关系。4、MST1高表达对人结直肠癌SW480细胞鼠移植瘤生长的影响构建SW480细胞的人结直肠癌裸鼠移植瘤模型,MST1进行基因治疗或联合5-FU共同治疗,观察移植瘤的生长情况,免疫组化分析移植瘤中MST1、Phospho-YAP1(Ser127)、及PUMA蛋白的表达,初步研究MST1抑制肿瘤生长的分子机制。结果:1、体外5-fu处理sw480细胞,随药物浓度和处理时间升高细胞生长抑制率明显升高,随5-fu作用浓度升高,mst1表达升高,yap磷酸化形成phospho-yap1(ser127)的水平升高,促凋亡相关蛋白p73、p53、puma及caspase3表达量显著升高。2、mst1高表达明显抑制sw480细胞生长,促进凋亡。体外介导p-egfp-mst1质粒转染sw480细胞,细胞生长抑制率及细胞凋亡率明显升高;与5-fu联合处理时,对细胞生长抑制率及凋亡率的升高更明显。3、mst1高表达促进p73、p53、puma、caspase-3蛋白表达及yap磷酸化水平。mst1升高,yap磷酸化成phospho-yap1(ser127)的水平升高及促凋亡相关p73、p53、puma、caspase3蛋白量及各相应mrna水平显著上升。4、mst1高表达下调ctgf、aregmrna的水平。体外介导p-egfp-mst1质粒转染sw480细胞后,yap表达水平下调,ctgf和aregmrna水平显著下调,5-fu联合处理能够促进mst1功能。5、mst1沉默促进sw480细胞的增殖,抑制sw480细胞凋亡。转染mst1-sirna3片段后sw480细胞生长抑制率及细胞凋亡率明显降低。6、沉默mst1下调p73、p53、puma和caspase-3mrna的水平及上调yap、ctgf、aregmrna的水平。沉默mst1使yap磷酸化形成phospho-yap1(ser127)的水平下降,促凋亡相关p73、p53、puma、caspase-3蛋白表达量及mrna水平显著下降,但yap的蛋白及mrna水平升高且ctgf和aregmrna水平上升明显。7、裸鼠移植瘤模型结果显示,应用mst1、5-fu及5-fu联合mst13个组在治疗27天后的平均瘤块体积和重量均显著低于control或阴性对照组,并且5-fu联合mst1治疗组的抑瘤效果更明显,并伴随着mst1、phospho-yap1(ser127)、puma蛋白的移植瘤组织阳性率的升高。结论:1、mst1高表达可抑制结直肠癌sw480细胞增殖,促进凋亡,且生长抑制率随着作用时间延长而加强;mst1与5-fu联合使用,对细胞增殖抑制及促凋亡效果更好;2、mst1高表达能够促进sw480细胞中yap1(ser127)蛋白的磷酸化及升高p73、p53、puma、caspase3蛋白表达量,降低了细胞中ctgf、aregmrna的水平。这可能是MST1抑制SW480细胞生长的重要机制之一;3、MST1高表达能增强结直肠癌SW480细胞对5-FU的敏感性,提高疗效。4、MST1高表达对结直肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤生长有较好的抑制作用,且与5-FU合用的效果更好;上述结果提示,MST1可以作为结直肠癌基因治疗的一个新靶点。