目的:以CA为模型药物,对外用皮肤给药制剂——软膏进行研究。CA是一种免疫抑制剂,口服可治疗排异反应,特应性皮炎等免疫性疾病,但是对于特应性皮炎等皮肤病,口服给药剂量大,易引起不良反应,因此将其制备成局部外用制剂,以皮肤组织为渗透屏障,限制CA软膏的全身吸收,从而达到治疗特应性皮炎,直达病灶,增强疗效,降低不良反应的目的。角质层是皮肤的天然屏障,如何使CA能够有效地被皮肤吸收而又尽可能减少或不进入全身血液循环,是制备局部给药制剂的关键。方法软膏含量测定方法:建立高效液相测定软膏含量的方法,对绝对回收率,相对回收率,精密度和灵敏度进行考察。制备工艺考察:通过单因素考察,采用熔融法制备CA局部皮肤外用软膏,以软膏的性状,含量及含量均匀度为评价指标,在单因素试验基础上进行水浴熔融温度为60,70,80℃,搅拌时间为5,10,15min和搅拌速度为4000,7000,10000r/min的三因素三水平正交试验确定制备软膏的最佳工艺条件。促透剂筛选:将不同促透剂以5%的比例加入到软膏中进行40℃,RH75%的条件下试验,于0,15,30天取样测定主药含量考察药物在促透剂中的稳定性;将初步筛选的处方进行家兔单次及多次刺激性试验,按照“皮肤刺激反应评分表”评分及“刺激强评分表”筛选促透剂;最后以进口软膏为对照,利用Franz扩散池进行软膏的体外渗透试验,建立高效液相测定接受液中主药浓度的方法,对绝对回收率,相对回收率,精密度和灵敏度进行考察,采用以尼龙膜为渗透屏障和以鼠皮为渗透屏障的体外渗透试验相互印证,考察相同含量促透剂、不同粘度和相同粘度、不同含量促透剂软膏的渗透行为,拟合方程并确定最佳促透剂含量及粘度。软膏的质量研究与稳定性考察:对最佳处方进行主药含量及含量均匀度的考察,进行高温,高湿,强光条件下影响因素试验长期试验,考察其外观,含量。急性毒性试验:以白色豚鼠为试验对象,涂抹大剂量受试物,对皮肤进行急性毒性试验。将豚鼠按体重,性别随机分为三组:给药组,空白基质组和空白对照组,分别考察自制软膏,空白赋型剂对豚鼠皮肤的急性毒性作用,并对各组豚鼠进行体重,呼吸,体毛,四肢活动,眼睛和粘膜,中枢神经系统的观察,并记录死亡率。致敏性试验:以白色豚鼠为试验对象,将其按体重,性别随机分为三组:阳性对照组,给药组和赋型剂组。阳性对照药物为二硝基氯苯,并将其配置成7%致敏浓度和0.5%激发浓度两种丙酮溶液,在第1,7,14天时涂抹致敏浓度溶液,28天时涂抹激发浓度溶液进行激发,观察其致敏现象。给药组及赋型剂组按上述同样方法操作,与阳性对照组比较观察致敏现象并计算致敏率。药效学试验:以家兔为试验动物,建立特应性皮炎模型,用二硝基氯苯对豚鼠进行致敏,激发,最后结成厚痂,使豚鼠的皮肤形成特应性皮炎。将豚鼠按体重,性别及结痂面积大小随机分成四组:进口软膏对照组,给药组,赋型剂组和空白组。前三组每天涂抹受试物两次,12小时一次,连续涂抹12天,并对四组皮炎的状态及面积进行观察,测量,以测定自制CA软膏的疗效。结果软膏含量测定方法:建立的高效液相测定软膏含量的标准曲线为A=12336C-7837.9 (r=0.9999,n=7),低,中,高三个浓度回收率分别是100.2,,100.4 ,99.67%,日内,日间RSD分别为1.5,1.4,2.1%和2.4,1.9,2.3%。制备工艺:通过正交试验优化了制备工艺,最后确定为:熔融温度为70℃,搅拌时间为10min及搅拌速度10000r/min。软膏均匀细腻,含量合格。促透剂选择:在40℃,RH75%条件下,1#,3#,4#软膏较稳定,其他软膏处方中CA的含量急剧降低;1#促透剂对家兔皮肤轻度刺激,3#,4#软膏对家兔无刺激;体外渗透试验建立的高效液相测定接受液中主药浓度的标准曲线为A=13.479C-373.4 (r=0.9999,n=5),低,中,高三个浓度回收率分别是104.6,101.1,98.47%日内,日间RSD分别为4.0,1.4,1.8%和4.5,1.9,2.0%;以时间为横坐标,累积渗透量为纵坐标拟合曲线表明,软膏的渗透行为符合Higuchi释药模型,以尼龙膜为渗透屏障和以鼠皮为渗透屏障的体外渗透试验结果趋势一致,均为渗透速率随着软膏粘度的增加或促透剂含量的增高而降低。以进口软膏作为对照品,确定的处方为含有7.7% 3#促透剂的中等粘度的软膏处方和含有10.9% 4#促透剂的中等粘度的软膏处方。结合皮肤刺激性试验,最后确定的处方为3#。软膏的质量研究:按3#处方软膏制备三批样品,主药平均含量为0.996mg/g,RH92.5%条件下软膏含量明显下降,无分层;60℃条件下,软膏含量第5天时测定含量变化不大,第10天时测定含量下降,膏体软化,变为液体,混浊;40℃条件下含量变化不大,膏体软化;4500±500lx条件下软膏含量急剧下降;长期试验在25℃,RH60%的条件下0,3,6,9个月的测定结果表明主药含量稳定。急性毒性试验:去除受试物后,连续7天对动物观察显示体重增长正常,呼吸,四肢运动,眼睛及粘膜,体毛和中枢系统均正常,动物无死亡。皮肤致敏性试验:经过二硝基氯苯的致敏激发,阳性对照组豚鼠在第28天激发后均出现了阳性反应,致敏部位皮肤呈现紫色红斑,72小时后仍不褪去;给药组和空白基质组豚鼠致敏部位皮肤正常,72小时后持续呈阴性,显示软膏无致敏性。药效学试验:利用二硝基氯苯成功地制造出特应性皮炎模型,炎症部位呈现深红色血痂;药效学试验研究结果显示,给药组与市售进口软膏对照组的豚鼠皮炎愈合速度明显快于赋型剂组和空白组,自制CA软膏与市售进口CA软膏疗效无显著性差别;空白基质疗效与市售进口CA软膏有显著性差异;空白组豚鼠的自愈效果与市售进口对照品有显著性差异。结论:以上各项试验证明,自制0.1% CA软膏渗透效果和稳定性良好,对皮肤无刺激,无致敏性,无急性毒性,符合局部外用制剂的要求,在对动物特应性皮炎的疗效上与市售进口CA软膏无显著性差异,对于临床用药有实际参考意义。