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猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的一种急性传染病,在我国被列为二类动物疫病,其临床主要表征为体温升高,母猪繁殖障碍,产死胎或木乃伊胎等。新生仔猪常表现为神经症状,死亡率非常高,成年猪常表现为隐性感染,一旦发病,很难根除。2011年前,我国广泛使用伪狂犬基因缺失疫苗,疫情得到很好控制。但是,2011年底以来,该病在我国免疫猪群再次暴发流行,给我国养猪业带来了巨大损失。本实验室先前分离获得PRV ZJ01高毒力毒株,并成功构建gE、gI和TK基因缺失毒株ZJ01△gE/gI/TK株。本研究采用该毒株,研制出具有热稳定性的冻干疫苗并测定其免疫保护效力,为该病新型疫苗研制奠定基础。研究包括以下部分:1.耐热冻干保护剂的筛选:本研究设计了五种耐热冻干保护剂(S151、S152、S153、S154、S155),与PRVZJ01△gE/gI/TK株病毒液混合,冷冻干燥。冻干疫苗37℃及-20℃放置1周,分别测定其TCID50,结果为:冻干前后S151、S152、S153、S154和S155对病毒的保护率分别为93%、95%、98%、88%和95%。37 ℃放置一周后,S151、S152、S153和S155冻干疫苗病毒效价平均下降量分别为1.88、0.33、1.13和2.06个滴度。-20℃放置1周,S151、S152、S153和S155冻干疫苗病毒效价平均下降量分别为0.52、0.21、0.47和1.16个滴度。使用配方S152制备成冻干疫苗放置4℃ 10个月后,病毒效价平均下降量为0.39个滴度。上述结果表明S152保护剂对PRV-ZJ01△gE/gI/TK株保护效果最佳。该保护剂主要成分为4%明胶、2%牛血清白蛋白、6%聚乙烯吡咯烷酮(K30)、2%山梨醇、0.05%Vc、15.2%蔗糖及4%ABC制剂,可用于疫苗生产。2.冻干疫苗免疫效力的测定:选择PRV阴性30日龄健康仔猪分为6个组,第1组接种Bartha疫苗、第2-5组分别接种102.0、103.0、104.0和105.0TCID50剂量的ZJ01△gE/gI/TK疫苗,第6组为PBS对照组,免疫后14天测定ELISA gB抗体与中和抗体效价,免疫后21天用1070TCID50 PRV-ZJ01株进行滴鼻攻击,攻毒后每天测定体温并观察临床症状,攻毒后14天观察病理变化,结果为:免疫两周后,所有疫苗接种猪血清gB抗体阳性,gE抗体阴性,1050TCID50免疫剂量组的中和抗体效价可达1:54.5。攻毒后PBS对照组100%发病,死亡2头。Bartha疫苗对照组40%发病,而ZJ01△gE/gI/TK疫苗免疫组均无明显临床症状。病理观察结果显示,PBS组所有猪肺脏萎缩、实变严重,脑组织出血,且较为松软,Bartha疫苗对照组,ZJ01△gE/gI/TK疫苗组并未出现明显病理变化。综上所述,接种102.0TCID50/ml的冻干疫苗可以保证猪体临床不发病,而综合各项免疫指标来看,接种105.0TCID50/ml的冻干疫苗免疫效果最好。3.冻干疫苗免疫途径的测定:选择PRV阴性30日龄健康仔猪分为3个组,第一组为PBS免疫组,第2,3组分别用肌肉注射和滴鼻注射接种1050TCID50剂量的ZJ01 △gE/gI/TK疫苗,免疫后14天测定ELISA-gB抗体与中和抗体效价,免疫后21天用107.0TCID50PRV-ZJ01株进行滴鼻攻击,攻毒后每天测定体温并观察临床症状,攻毒后14天观察病理变化,结果为:所有冻干疫苗接种猪血清gB抗体阳性,gE抗体阴性,两组105 0TCID50免疫剂量组均能诱导机体产生高水平的中和抗体且差异不显著。攻毒后PBS对照组100%发病,死亡2头,而两组ZJ01△gE/gI/TK疫苗免疫组均无明显临床症状。病理观察结果显示,PBS组所有猪肺脏萎缩、实变严重,脑组织出血,且较为松软,两组ZJ01△gE/gI/TK疫苗剂量组并未出现明显病理变化。综上所述,滴鼻与肌肉注射均能为猪群提供充足的保护。