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目的:研究DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferases1,DNMT1)和甲基化-Cp G-结构域结合蛋白1(Methyl-Cp G-binding Domain protein 1,MBD1)对P19中DNA甲基化的动力学的影响。方法:(1)培养P19细胞,然后将携带MBD1短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)#2号慢病毒载体和Scramble(无意义)sh RNA转染到P19细胞中,给予嘌呤霉素(puromycin)筛选出已感染的细胞;利用荧光显微镜、qPCR验证慢病毒载体对P19细胞MBD1敲减效率。(2)用MTT法检测给予不同浓度(2.5、5、10、20和40μmol/L)的5-氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)在24h、48h、72h对P19细胞的抑制率,筛选出最佳的5-Aza浓度,并利用qPCR和Western blotting筛选出最佳的作用时间。培养5-Aza处理的P19细胞,然后利用qPCR和Western blotting检测MBD1、DNMT1、DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferases 3a,DNMT3a)、DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferases 3b,DNMT3b)以及TET(ten-eleven translocation)1,TET2,TET3 mRNA和蛋白表达水平,利用ELISA法测定细胞中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine content,5-m C)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxy-methylcytosine,5-hm C)蛋白的含量。(3)培养已转染慢病毒载体的P19细胞,用qPCR和Western blotting检测MBD1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b以及TET1、TET2、TET3 mRNA和蛋白表达水平;ELISA法测定细胞中5-m C、5-hm C蛋白的含量;结果:(1)利用荧光显微镜观察P19细胞感染慢病毒72h后绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达情况,使用嘌呤霉素筛选后sh MBD1慢病毒载体感染效率在90%以上;qPCR结果显示,Scramble组与对照组相比,无显著性差异(P>0.05),表明慢病毒本身对细胞MBD1 mRNA水平无明显影响;#2慢病毒转染组与Scramble组相比,MBD1 mRNA水平均下降,差异具有显著性(P<0.01),敲减率可达86.07%。Western blotting进一步证明#2慢病毒可使P19细胞的MBD1蛋白表达水平下降(P<0.01),其对P19细胞MBD1蛋白表达的抑制作用可达68.60%。(2)MTT法检测显示5-Aza以10、20和40μmol/L作用24h、48h和72h时,细胞抑制率增加,呈剂量依赖性;给予P19细胞10、20和40μmol/L 5-Aza,利用qPCR检测各时间点DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和5-hm C mRNA表达水平,结果显示DNMT1除了10μmol/L作用24h之外,其它各浓度各时间点的mRNA水平均下降,且呈时间和剂量依赖性(P<0.01);当浓度为40μmol/L时,作用24h、48h和72h后DNMT3a mRNA水平均下降(P<0.01);在5-Aza剂量为10μmol/L时作用24h、48h和72h后DNMT3b mRNA水平均升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01,各自的)、5-Aza剂量为20μmol/L、40μmol/L时各自作用48h和72h后DNMT3b mRNA水平升高(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,各自的);5-hm C mRNA水平随作用时间延长(24h到72h)和浓度的增加(每个时间点下浓度分别为10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L)逐渐上升(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,各自的)。然后给予细胞20μmol/L 5-Aza,利用qPCR检测各个时间点MBD1、TET1、TET2、和TET3 mRNA水平,利用Western blotting检测各个时间点MBD1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和TET1、TET2、TET3蛋白表达水平。qPCR结果显示在48h和72h时MBD1和TET1 mRNA水平增加(P<0.01);TET2 mRNA水平在24h、48h和72h均升高(P<0.01)。Western blotting结果显示MBD1在48h时蛋白表达水平升高(P<0.01);DNMT1在48h和72h时蛋白表达水平降低(P<0.01);DNMT3a、DNMT3b和TET3各时间段的蛋白表达水平无明显改变(P>0.05);TET1在72h时蛋白表达水平增加(P<0.05);TET2的蛋白表达水平在24h、48h、72h时均升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01,各自的);ELISA结果显示给予不同浓度(10、20、40μmol/L)不同作用时间(24h、48h、72h)的5-Aza后,P19细胞中5-m C的表达水平与对照组相比,除24h 10μmol/L外其余均有所下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,各自的),5-hm C的表达水平除24h 10μmol/L、48h 10和20μmol/L外其余组较对照组显著上升(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01,各自的),且呈剂量和时间依赖性。(3)慢病毒转染好的P19细胞,利用qPCR和Western blotting检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、TET1、TET2、TET3及5-hm C mRNA表达水平,qPCR结果显示,Scramble组与对照组相比,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、TET1、TET2、TET3及5-hm C mRNA水平没有明显差异;sh MBD1组与Scramble组相比,TET1 mRNA水平没有明显改变,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、TET2、TET3及5-hm C mRNA水平均增加(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05,各自的);Western blotting结果显示,Scramble组与对照组相比,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和TET1、TET2、TET3的蛋白表达水平没有明显差异(P>0.05);sh MBD1组与Scramble组相比,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及TET2、TET3蛋白表达增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05,各自的),TET1蛋白表达水平没有明显变化(P>0.05)。ELISA结果显示MBD1敲减组5-m C的表达水平与Scramble组相比较明显下降(P<0.01),而5-hm C的表达水平较Scramble组显著升高(P<0.01),且呈剂量和时间依赖性。结论:5-Aza能有效降低DNMT1 mRNA和蛋白表达水平;#2重组MBD1 sh RNA慢病毒载体能有效降低MBD1 mRNA和蛋白表达水平;MBD1和DNMT1相互影响相互作用,共同维持DNA甲基化的动态平衡;DNMT1与TET3相互作用,而MBD1通过直接调控P19细胞TET1维持细胞内5-m C和5-hm C的动态平衡,因此DNMT1和MBD1在DNA甲基化动力学稳态维持中扮演着重要的角色。