DOR-GLT-1/GS-NMDA受体通路在瑞芬太尼痛觉过敏中的作用及氢气治疗作用研究　　目的：　　探讨DOR-GLT-1/GS-NMDA受体通路在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的作用以及饱和氢盐水缓解瑞芬太尼诱发的痛觉过敏的具体机制探究。　　内容制作大鼠切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏模型，从在体水平证明DOR-GLT-1/GS-NMDA受体通路相关蛋白或受体表达水平或功能的改变在阿片类药物引发的痛觉过敏过程中发挥的重要作用。建立大鼠体外脊髓片孵育模型，从离体水平证明DOR在瑞芬太尼诱发的NMDA受体电流变化中发挥重要调控作用。从在体水平证明HS是通过修复GLT-1、GS及NMDA受体功能进而缓解痛觉过敏的发生，为临床痛觉过敏的预防和治疗提供新的思路。　　方法：　　该研究主要分为三部分：第一部分：尾静脉置管成功的雄性SD大鼠40只，随机数字法分为5组，每组8只：对照组（C组）：尾静脉持续输注生理盐水（NS）；切口痛组（I组）：经尾静脉持续输注NS，同时按照Brennan法建立切口痛模型；甘氨酸组（G组）：经尾静脉持续输注甘氨酸15μg·kg-1·min-1，同时建立切口痛模型;瑞芬太尼组（R组）：经尾静脉持续输注瑞芬太尼，不建立切口痛模型；瑞芬太尼+切口痛组（RI组）：经尾静脉持续输注瑞芬太尼，同时建立后足手术切口；生理盐水或瑞芬太尼的输注剂量分别为0.1ml·kg-1·min-1或1.0μg·kg-1·min-1，输注时间恒定，均为1小时。于输注前1天（基线值）、术后2h、6h、24h、48h测定机械性缩爪阈值（PWT）和热刺激缩爪潜伏期（PWL），在行为学测定结束后取L4-6脊髓节段，采用免疫沉淀及免疫印迹法测定大鼠脊髓背角DOR膜蛋白及总蛋白，MnSOD、GLT-1、GS总蛋白及硝基化蛋白及NMDA受体NR1，NR2A，NR2B亚基硝基化蛋白，膜蛋白和总蛋白的表达水平变化。第二部分：在体实验：鞘内置管及尾静脉置管成功的雄性SD大鼠32只，随机分为4组（n=8）：DOR激动剂deltorphin II或抑制剂naltrindole+RI组（D+RI组或 N+RI组）：在经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1前，鞘内给予4nM deltorphin II(10μl)或30nM naltrindole(10μl)，再行切口痛模型；C组及RI组同上。采用免疫沉淀及 Western Blot法测定大鼠脊髓 MnSOD，GLT-1,GS及NMDA受体NR1，NR2A，NR2B亚基硝基化蛋白，膜蛋白和总蛋白的表达情况。离体实验：取出生14-18天的雄性SD乳鼠40只，随机分为5组（n=8）：C组，取腰段脊髓（L4-6），制备脊髓片，置入人工脑脊液（ACSF）中孵育；G组：脊髓片置入含甘氨酸的ACSF中；R组，脊髓片置入含瑞芬太尼的ACSF中；RD组，脊髓片置入含瑞芬和DeltorphinⅡ的ACSF中；RN组，置入含瑞芬和naltrindole的ACSF中，甘氨酸、瑞芬、DeltorphinⅡ及naltrindole终浓度分别为0.24μmol/L、4nmol/L、10nmol/L和1nmol/L。孵育1小时后，显微镜下找到脊髓背角神经元，运用全细胞膜片钳技术记录此处NMDA受体介导的微小兴奋性突触后膜电流（mEPSC）。第三部分：48只雄性SD大鼠，随机数字表法分为6组，每组八只：饱和氢盐水（HS组）：以10ml/kg剂量经腹腔注射饱和氢盐水，十分钟后，经尾静脉置管输注等剂量NS；HS+RI组：以1ml/kg、3ml/kg、10ml/kg剂量经腹腔注射饱和氢盐水，十分钟后，经尾静脉输注瑞芬太尼并建立切口痛模型，生理盐水或瑞芬太尼输注剂量及输注时间，以及C组及RI组同上。应用免疫沉淀和Western blot法测定大鼠脊髓MnSOD,GLT-1,GS及NMDA受体NR1，NR2B亚基硝基化蛋白的改变。　　结果：　　与C组相比，I组、R组、RI组均发生痛觉过敏且伴有DOR及NR1、NR2B膜蛋白和总蛋白表达增加，MnSOD、GLT-1、GS及 NMDA受体 NR1，NR2B亚基硝基化蛋白表达增加。DOR抑制剂显著抑制痛觉过敏的发生，降低MnSOD、GLT-1、GS及NR1，NR2B亚基硝基化蛋白表达水平，抑制NR1及NR2B膜蛋白的增加。与C组比，R组和RD组NMDAR介导的mEPSCs的振幅增强和频率增加。HS剂量依赖性抑制瑞芬太尼痛觉过敏的发生，并降低 MnSOD、GLT-1、GS及NR1，NR2B亚基硝基化蛋白表达水平。　　结论：　　瑞芬太尼可能是通过DOR膜上转运，引起GLT-1及GS功能受损，进而导致NMDA受体表达及功能改变诱发痛觉过敏。HS可能是通过修复GLT-1、GS及NMDA受体功能缓解痛觉过敏的发生。