论文部分内容阅读
1.应用mSILAC技术寻找胰腺癌诊断标志物周转率高的蛋白可以作为胰腺癌诊断的候选标志物。但分泌蛋白的鉴定一直是一个非常困难的课题,由于血清或培养液中包括白蛋白在内的高丰度蛋白的干扰常常使得低丰度的分泌蛋白很难被鉴定。利用15N氨基酸可以标记体外培养的胰腺癌细胞新合成的蛋白,通过数学算法则可计算出这种蛋白的周转率,而周转率高的蛋白可以纳入胰腺癌诊断的候选标志物。mSILAC是将SILAC技术与这种数学算法相结合的技术。本文运用mSILAC技术,以期找出胰腺癌诊断的候选标志物。本文首先用含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养MIA PaCa-2细胞,然后再使用含有或不含50% 15N氨基酸的无血清DMEM培养液进行培养,同时加入肿瘤抑制物羟基硫胺素(oxythiamine, OT),研究其对分泌蛋白的影响。使用二维凝胶电泳和MALDI-TOF/TOF鉴定差异表达的蛋白、计算蛋白的周转率并在血清样本中鉴定所得的分泌蛋白作为胰腺癌候选标志物的可靠性。结果发现在鉴定出来的14个与对照组和OT处理组中有差异表达的分泌蛋白中,基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteases-1,TIMP-1)和细胞角蛋白-10(Cytokeratin-10)的蛋白周转率达到了90%以上。进一步利用Western Blot和酶联免疫吸附试验分别证明TIMP-1在人胰腺癌血清与正常组血清中的表达情况。并将TIMP-1与现有的胰腺癌诊断标志物CA19-9进行对比,评估了TIMP-1作为胰腺癌诊断候选标志物的可行性和可靠性。结果证明：将mSILAC技术与无血清培养相结合,能够成功鉴定出低丰度的分泌蛋白,同时证明这种方法对于发现血清中各类潜在标志物是可行和可靠的。2.人类新基因Nle1的克隆、表达与功能研究脊椎动物的心脏发育过程牵涉到一系列基因的不同的时空表达、蛋白-蛋白相互作用以及信号分子的传递等过程。Notch信号途径在心脏发育过程中起着关键作用,研究发现Notch信号途径的异常将导致心脏发育异常。Nle1的果蝇同源基因Notchless与Notch相互作用,通过WD40结构域与Notch的胞质结构域结合,抑制Notch基因在果蝇中所产生的缺翅等表型。当减少Notchless的水平时,Notch的水平上升。本文克隆了一个新的人类心脏发育候选基因Nlel,通过报告基因系统研究了人类Nlel基因与Notch的相互作用,结果表明Nlel也是通过WD40结构域抑制Notch的活性,同时利用报告基因系统研究了Nlel对MAPK信号途径的下游转录因子AP-1和SRE复合物的转录活性分析,发现可以使它们的转录活性下降,提示Nle1可能通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程。