角膜病是我国主要的致盲眼病之一。同种异体角膜移植是目前治疗角膜盲最为有效的方法。由于角膜处于机体免疫赦免地位，角膜移植是器官和组织移植中最常见和成功率最高的手术，但免疫排斥反应仍是目前造成其手术失败的主要原因，穿透性角膜移植的排斥反应发生率仍占10-30％，尤其在血管化角膜、角膜严重感染、大植片移植术、第二次移植等，免疫排斥率高60％。因此，如何降低和预防角膜移植术后排斥反应已成为目前临床亟待解决的问题，研制高效低毒的免疫抑制药物是解决此问题的研究热点之一。 目前环孢霉素A（CsA）为主的免疫抑制剂在临床已得到广泛应用。现行的方法主要有皮质类固醇、环孢霉素A、FK506等抑制免疫反应。这些免疫抑制剂的应用，虽然大大提高了角膜移植的成功率，提高了角膜植片的存活率，但是仍有部分病例排斥反应不能逆转。长期运用这些免疫抑制剂对机体有很大的毒性作用如肾毒性、神经系统毒性以及免疫抑制剂常有的并发感染和引起激素性青光眼等。故而，开发新型强效毒性小的免疫抑制剂亟待解决。 转化生长因子-β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）是一类具有多种生物活性的细胞因子。属于一个结构相关的调节蛋白超家族，其中包括活化素（activin）、抑制素（inhibin）、骨形态发生蛋白（BMP）等。TGF-β是一种相对分子量为25000（25kDa），由两个结构相同或相似的、分子量为12．5kDa亚基借两个二硫键连接的二聚体，只有两个相同或不同的亚单位组成的二聚体的形式才有生物活性。TGF-β有4个亚型，哺乳动物只表达其中3个，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三者的序列同源性为70％～80％，人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3均含有7个外显子，分别定位于第19号、第1号和第14号染色体。人和大鼠TGF-β1的同源性高达99％。许多细胞表面都有TGF-β受体。TGF-β1对免疫反应的多个环节具有下降性调节作用。它具有作为免疫抑制剂用于防治器官移植免疫排斥的潜在性。体外实验已证明：它作为一种自动分泌的负性信号，具有抑制多种白细胞介素（IL）和其他细胞因子产生的正性信号而抑制淋巴细胞增殖功能。可抑制T细胞、B细胞的活化和增殖，抑制自然杀伤细胞和巨噬细胞的功能。因此，它具有作为免疫抑制剂用于防治器官移植免疫排斥的潜在性。本实验旨在观察对角膜移植排斥反应的防治作用，并讨论其作用机制。本文为阐明TGF-β1的免疫抑制作用机理，为今后治疗角膜移植排斥反应提供理论依据。TGF-β1具有强力的抑制免疫功能和促进角膜愈合的作用。对同种异体移植免疫排斥反应和自身免疫性疾病具有较好的治疗效果。 本实验对大鼠应用不同浓度TGF-β1滴眼液，观察表面应用后在大鼠房水中的药物浓度，观察其能否在房水中保持较高浓度，寻找合适的药物治疗浓度，从而发挥其预防和治疗角膜移植排斥作用；通过建立大鼠穿透性角膜移植模型，观察表面使用治疗浓度的TGF-β1滴眼液对角膜移植排斥反应的影响，监测某时间点角膜植片的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的表达，研究TGF-β1能够在局部发挥药物作用的药物浓度，避免可能出现的药物全身应用的不良反应。从而进一步探讨TGF-β1的作用机制，为今后抗角膜移植排斥反应的临床药物治疗提供新的选择以及实验依据。 研究目的： 1．房水中药物浓度观察：探讨不同剂量的TGF-β1滴眼液表面应用后在房水中的药物浓度，观察其能否及哪一种浓度的滴眼液能在房水中保持较高浓度，从而发挥其预防和治疗角膜移植排斥作用。并研究添加不同的药物附剂对药物疗效的影响，评价其效果，为将来应用于临床提供有效的给药方案。 2．机制探讨： （1）角膜移植大鼠模型应用治疗浓度的TGF-β1滴眼液后，观察大鼠角膜植片的存活时间。 （2）在植片急性排斥期，检测空白对照组和使用TGF-β1滴眼液组植片的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的表达。这些结果可以帮助我们从角膜排斥反应的免疫途径对TGF-β1的可能机制进行探讨。 研究方法： 1．配制0．5μg/ml、1μg/ml、2μg/mlTGF-β1滴眼液。滴眼后，应用酶联免疫吸附法定量测定房水和血浆中的。TGF-β1浓度。 采用SPSS13．0forwindow统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，不同组别大鼠房水中的TGF-β1浓度的比较采用单向方差分析（One-WayANOVA）和不同组别大鼠血浆中的TGF-β1浓度的比较采用独立样本t检验（Independent-SamplesTTest），各组之间比较采用DunnettT3方法，显著性标准为α=0．05。 2．以SPF级Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，建立同种异体穿透性角膜移植模型，随机分组（A、B、C）共3组，A组：空白对照组，B组：1％CsA滴眼组，C组：TGF-β1滴眼液，各组从术后第一天开始用药，用至第14天停药。用裂隙灯显微镜观察比较各组角膜植片在术后12天透明度、水肿度、新生血管度、移植排斥指数（RI）情况以及发生排斥时间。 采用SPSS13．0forwindow统计学软件进行分析，记录植片的存活时间，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组植片的存活时间比较采用单向方差分析（One-WayANOVA），各组之间比较采用LSD方法，显著性水准为α=0．05。 3．以SPF级Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，建立同种异体穿透性角膜移植模型，随机分组（A、B、C）共3组，A组：空白对照组，B组：1％CsA滴眼组，C组：TGF-β1滴眼组，各组从术后第一天开始用药，用至第12天停药，取角膜植片，制作石蜡切片，HE染色，光镜下观察各组角膜植片病理学改变，免疫组织化学染色（SABC法）检测角膜植片中TNF-α和IFN-γ在各组角膜组织的表达及分布情况。 测定结果计量资料均以均数士标准差（x±s）表示，采用SPSS13．0统计学软件处理。不同组别大鼠角膜植片中阳性细胞的记分比较采用单向方差分析（One-WayANOVA），各组之间比较采用LSD方法，显著性水准为α=0．05。 研究结果： 1．肉眼与裂隙灯显微镜观察，实验前后和实验过程中，各组大鼠眼均无结膜分泌物、球结膜充血、角膜水肿、角膜后沉着物、前房炎性反应及晶状体混浊改变。 2．TGF-β1滴眼液在A、B、C、D组大鼠眼房水中的平均浓度为0．361ng/ml、0．452ng/ml、2．127ng/ml、2．218ng/ml。B组和对照组眼房水中TGF-β1浓度P>0．05，无显著性差异。C、D组和对照组眼房水中TGF-β1浓度F=26．060，P=0．000，有显著性差异。C、D组之间TGF-β1浓度比较，P>0．05，没有显著性差异（表1）。说明0．5μg/mlTGF-β1滴眼液不能有效提高房水中TGF-β1浓度，1．0μg/ml和2．0μg/mlTGF-β1滴眼液能有效地穿透角膜进入房水，在局部发挥其生物学效应，而1．0μg/mlTGF-β1滴眼液用药前后血浆中TGF-β浓度分别为1．868ng/ml、3．110ng/ml。实验组和对照组眼血浆中TGF-β1浓度作t检验，P>0．05，不具有显著性差异（表2）。说明1．0μg/mlTGF-β1滴眼液不会影响全身TGF-β1水平，在达到局部发挥作用治疗眼部疾病的同时．可降低其全身不良反应发生率。 3．1％CsA滴眼组和TGF-β1滴眼液组角膜植片在术后12天透明度、水肿度、新生血管度、移植排斥指数（RI）等抗排斥效果方面分析均显著提高角膜植片的存活时间（P<0．01）。 4．急性排斥期角膜植片的病理及免疫组化检查： HE染色：空白对照组植片显著增厚，大量单核细胞和淋巴细胞浸润，TGF-β1滴眼液组角膜植片厚度正常，无明显炎性细胞浸润。 免疫组化：TGF-β1滴眼液组的植片TNF-α和IFN-γ阳性细胞数量均较空白对照组减少（P<0．05）。 结论： 1．TGF-β1滴眼液滴眼可以有效防治角膜移植排斥反应，延长角膜植片存活时间。 2．TGF-β1滴眼液浓度为1．0μg/ml即可达到有效的治疗浓度，而且毒副作用极少。 3．TGF-β1滴眼液可减少急性期植片中TNF=α和IFN-γ蛋白的表达，而且可以迅速减少炎症细胞对角膜植片的浸润，这可能就是TGF-β1抗排斥的主要机制之一。