论文部分内容阅读
严重创伤、大手术后及其他危重病人往往伴有严重的革兰氏阴性菌感染,最终可发展为内毒素血症,甚至内毒素休克,是目前危重症治疗领域非常棘手的问题。革兰氏阴性菌的致病物质基础是被称为内毒素的脂多糖(LPS),近年研究证明,LPS主要通过一种跨膜蛋白Toll-like receptor 4(TLR4)将炎症信号传入胞内,进一步激发一系列炎症反应。若能在TLR4水平阻断该信号转导通路,那么就有可能抑制过度的炎症反应。基于此,本实验拟通过真核系统表达TLR4胞外段,并观察它对LPS所致炎症反应的影响。方法:首先通过PCR技术从携带TLR4全长cDNA的质粒pCMV-TLR4上扩增获得TLR4胞外段cDNA,将后者克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-eTLR4,通过酶切分析及测序给予鉴定。然后将pcDNA3.1(+)-eTLR4通过脂质体转染法转入HEK293细胞,在mRNA水平观察TLR4胞外基因的表达。最后我们用G418筛选稳定表达TLR4胞外段HEK293细胞,用培养液上清作用于诱导分化成熟的U937细胞,通过ELISA观察该细胞TNF-α的分泌变化。结果:1.从携带TLR4全长cDNA的质粒pCMV-TLR4上成功扩增获得TLR4胞外段cDNA,片段大小1.8kb,与理论值一致。2.将TLR4胞外段cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),通过酶切分析及测序证明成功构建了真核表达质粒cDNA3.1(+)-eTLR4,其插入片段的碱基序列、两端的酶切位点及读码框完全正确。3.通过脂质体转染法,将pcDNA3.1(+)-eTLR4和pcDNA3.1(+)分别转染HEK293细胞后,在mRNA水平证明:前者有TLR4胞外基因表达,而后者无任何表达。4.LPS能刺激诱导分化成熟的U937细胞TNF-α的分泌量增加(p<0.01),其分泌量随LPS剂量增加而增加。5.稳定表达TLR4胞外段的HEK293细胞培养液上清能减少诱导分化成熟的U937细胞TNF-α的分泌量(p<0.01),并随剂量增加而降低;而稳定表达TLR4胞外段的HEK293细胞裂解液对TNF-α的分泌无明显影响;同时转染空载体的细胞培养液上清对TNF-α的分泌亦无明显影响。6.细胞培养液上清在不同时刻给予,对诱导分化成熟的U937细胞TNF-α的分泌量有所影响,随给药时间延迟TNF-α的分泌量有逐渐降低的趋势。