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新城疫(Newcastle disease,ND)仍然是威胁养禽业的一种主要疾病,给养禽业造成巨大的损失,国际兽医局(Office Internation des Epizooties,OIE)将其与高致病性禽流感一起列为危害养禽业的必须报告的疾病。自1997年以来,华南和华东地区部分省市发生了新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染鹅的病例,虽然各地采取了积极的防治措施,但该病仍然逐渐蔓延、流行。有不少学者对此进行了研究,但有关病原的生物学特性及流行病学等方面,仍存在很多疑问。
1、斑嘴鸭源新城疫病毒的分离纯化与毒力鉴定
本研究从盐城国家自然保护区的斑嘴鸭群中,采集肛拭子,经实验室常规处理接种鸡胚,收集24h后致死鸡胚的尿囊液,采用病毒蚀斑纯化技术纯化病毒,结果分离获得三株病毒:通过透射电镜观察,新分离病毒呈典型的新城疫病毒粒子的形态结构:以抗NDV鸡多抗血清为一抗作间接免疫荧光试验(IFA),结果观察到特异性的亮绿色荧光,证明该病毒为新城疫病毒,分别命名为7XJS061、8XJS062、12JS063。用这些病毒接种鸡胚,结果鸡胚死亡,胚体全身出血。病毒的主要致病指数如鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)及组织培养半数感染量(TCID<,50>)的检测结果表明,3株病毒的MDT分别为52h、48h、46h,ICPI为1.523(L2JS063),TCID<,50>分别为10<5.625>/0.1ml、10<7.25>/0.1ml、10<8.625>/0.1ml。试验结果证明来源于野生斑嘴鸭的3株NDV为新城疫强毒。
2、斑嘴鸭源新城疫病毒融合蛋白(Fusion protein)基因的克隆及序列分析
根据Genbank上己发表的NDV F基因序列设计一对扩增F基因的引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,并经克隆和测序,结果获得了野鸭源NDV7XJS061、8XJS062、L2JS063 F基因约1662bp的片段,序列分析结果表明,3株野鸭源NDV F蛋白的裂解序列为<112>R/K-R-Q-K/R-R-F<117>,与NDV强毒株的特征一致。对获得的3株野鸭源病毒F基因的序列与Genbank上发表的鹅源、鸡源、鸭源等病毒的F基因的相应序列进行比较,结果7XJS061、8XJS062、L2JS063与鹅源病毒ZJ1株之间的同源性为97.5%-97.6%,与鸭源病毒semi-muscovy duck FMl株之间的同源性为84.3%-84.4%,与鸡源标准弱毒株LaSota的同源性为84.5%,与鸡源强毒株F48E9株的同源性为97.5-97.6%,与猪源swine SP13株的同源性为84.5%-84.6%,与Ch983的同源性为98.1%-98.2%。本研究表明,斑嘴鸭源NDV可能与同期或稍早期的鸡源NDV流行有密切的关系。
3、斑嘴鸭源新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因C-末端部分片段的克隆及序列分析
根据Genbank上已发表的NDV血凝素-神经氨酸酶基因C-末端基因的部分片段基因序列设计三条扩增HN C-末端基因的引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增分离株血凝素-神经氨酸酶基因C-末端基因的部分片段,经克隆测序,获得约340bp的片段,序列分析结果显示,3株病毒的终止密码子在同一位置,且与标准强毒株F48E8的终止密码子位置相同,但比标准弱毒株Lasota的HN少18个碱基,说明3株野鸭源病毒为强毒株,而且可能来源于鸡群内同期或稍早期的NDV强毒株。