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胰腺癌（pancreas cancer）是恶性程度较高的肿瘤之一,其发病率呈上升趋势。大多数胰腺癌患者出现症状就诊时已属中晚期,即使手术治疗,预后亦较差,且其具有周围血管浸润和嗜神经生长特性,早期诊断率较低,易于转移,其分化程度和淋巴转移直接影响患者的预后,因此,对于深入研究胰腺癌的治疗意义重大。趋化因子（chemokine）是一类结构同源、功能相似的细胞因子超家族,其作用是启动并调节特异性细胞在体内迁移与定位,其中部分细胞正是机体抗肿瘤免疫的效应细胞。次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid tissue chemokine,SLC）属于CC亚族趋化因子,即CCL21,通过趋化、介导免疫细胞产生抗肿瘤免疫应答,发挥抗肿瘤免疫效应,但其又具有双向效应,可促进肿瘤细胞分泌蛋白水解酶,加快肿瘤细胞的侵袭转移,导致肿瘤进展。慢病毒（Lentivirus）载体是一类重组反转录病毒载体,由慢病毒经过改造而成,具有更高的生物安全性和外源基因的表达效率,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,并可以在体内较稳定的表达,其感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒,安全性好。慢病毒载体是目前基因治疗中研究较多的载体。目的本课题研究通过克隆人的CCL21基因,构建pEASY-T1 simple-CCL21质粒,经序列测定后进一步构建人CCL21基因慢病毒表达载体,稳定转染Real-time PCR筛选出的高表达CCR7的胰腺癌细胞株PANC-1,观察细胞生物学行为的变化,进一步通过PCR基因芯片检测目的基因转染后细胞内信号通路中某些基因的变化,探讨人CCL21基因转染对胰腺癌的作用。方法1.利用基因克隆技术克隆出人CCL21基因,连接在pEASY-T1 simple cloning vector上,构建成pEASY-T1 simple-CCL21质粒,再进行序列测定;2.利用基因重组技术将人CCL21基因连接慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,进行病毒包装,滴度测定后浓缩纯化;3.利用Real-time PCR从培养的5种人胰腺癌细胞株（AsPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,PANC-1,SW1990）中筛选出高表达CCR7的细胞株;4.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CCL21重组慢病毒载体转染PANC-1细胞株,分为阳性实验组、阴性对照组、空白对照组,利用PCR、Western blot技术进行验证,观察转染后PANC-1细胞株生物学行为的变化。5.采用RT2ProfilerTMPCR芯片检测与肿瘤侵袭转移、血管生成、凋亡、黏附、细胞周期、信号转导等有关因子的84个基因,深入分析基因变化趋势,Western blot验证,探讨人CCL21基因对PANC-1细胞株侵袭转移的作用。实验结果均采用SPSS16.0统计软件进行t检验和单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.克隆出人CCL21基因,成功构建pEASY-T1 simple-CCL21质粒,测序结果显示与人类基因库中CCL21基因序列完全一致;2.成功构建慢病毒载体质粒PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-CCL21,经病毒包装后得到携带hCCL21的成熟的重组慢病毒颗粒Lenti-hCCL21,浓缩后病毒滴度达到1.25×108TU/ml;3.从5种人胰腺癌细胞株（AsPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,PANC-1,SW1990）中筛选出高表达CCR7的细胞株PANC-1;4.重组慢病毒颗粒Lenti-hCCL21成功转染胰腺癌细胞株PANC-1,并稳定表达,但PANC-1细胞生物学行为无明显变化;5.通过RT2ProfilerTMPCR芯片筛选出8个明显变化基因,其中上调基因2个,分别为:ATM,BRCA1;下调基因6个,分别为:AKT1,CASP8,FOS,IL8,ITGA2,JUN;根据基因功能不同分类,其中与凋亡有关基因为CASP8;与信号转导与转录有关基因为AKT1,FOS,JUN;与细胞周期有关基因为ATM,BRCA1;与血管生成有关基因为IL8;与粘附作用有关基因为ITGA2;此外,MMP-9基因变化低于2倍,阳性实验组比空白对照组、阴性对照组分别上调1.40倍,1.31倍,而TIMP1基因阳性实验组比空白对照组、阴性对照组分别下调1.01倍,1.02倍,Western blot检测结果显示阳性实验组MMP-9的表达量比阴性对照、空白对照组增加。结论本课题研究,利用基因克隆技术成功克隆出人CCL21基因,采用基因重组技术成功构建CCL21重组慢病毒载体,包装成熟的重组慢病毒颗粒Lenti-hCCL21稳定转染高表达CCR7的胰腺癌细胞株PANC-1,但转染后的PANC-1细胞其生物学行为未发生明显变化,进一步通过RT2ProfilerTMPCR芯片筛选出与肿瘤侵袭转移、血管生成、凋亡、黏附、细胞周期、信号转导等相关明显变化的基因,表明hCCL21基因稳定转染胰腺癌细胞株PANC-1引起了胞内信号转导通路中某些基因的变化;其中MMP-9基因上调与TIMP1基因下调表明Lenti-hCCL21转染胰腺癌细胞株PANC-1可能增强其侵袭转移能力,为进一步研究体内实验奠定基础。