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背景:垂体泌乳素腺瘤患者首选口服多巴胺受体激动剂（dopamine agonist,DA）进行治疗,但部分患者对DA耐药。我们的前期研究发现,两种垂体泌乳素腺瘤细胞系（GH3与MMQ）对两种最常用的DA药物溴隐亭（bromocriptine,BRC）和卡麦角林（cabergoline,CAB）的敏感性及内在作用机制存在差异:GH3细胞系对CAB相对耐药,CAB主要通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）通路导致肿瘤发生以自噬为主的细胞死亡;而MMQ细胞系对BRC相对耐药,BRC主要通过激活早期生长反应因子1（early growth response 1,EGR1）通路导致肿瘤发生以凋亡为主的细胞死亡。经过通路检索我们发现,AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）作为上游信号,具有调控m TOR和EGR1两条信号通路的能力。因此,理论上可以把AMPK作为靶点,抑制m TOR信号通路和（或）激活EGR1信号通路,起到逆转CAB和（或）BRC耐药的治疗作用。ACT001作为小白菊内酯（一种中草药提取物）类似物的衍生物,可通过抑制线粒体内的超氧化物歧化酶活性,从而提高细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,进而激活AMPK。本研究验证了ACT001通过激活AMPK介导m TOR或EGR1,逆转垂体泌乳素腺瘤对DA的耐药,从而达到治疗耐药性泌乳素腺瘤的目标。第一部分:ACT001通过ROS-AMPK途径诱导DA耐药性垂体泌乳素腺瘤细胞死亡目的:验证ACT001可通过提高细胞内ROS水平,升高细胞内AMP/ATP比值,进而激活AMPK,诱导DA耐药性垂体泌乳素腺瘤细胞死亡。方法:将GH3细胞分为对照组、CAB处理组、ACT001处理组、CAB+ACT001处理组以及CAB+ACT001+N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）处理组;将MMQ细胞分为对照组、BRC处理组、ACT001处理组、BRC+ACT001处理组以及BRC+ACT001+NAC处理组。通过CCK8比色法及细胞克隆形成实验比较不同药物处理后细胞增殖能力的改变,采用荧光探针来检测细胞内ROS水平,使用高效液相色谱-质谱联用法测定各组细胞中AMP/ATP比值,使用Western Blot评估细胞AMPK蛋白表达水平。结果:对于GH3细胞,CAB+ACT001组较CAB组及ACT001组细胞存活率明显更低（36.80±6.40%vs 52.07±5.61%,P<0.05;36.80±6.40%vs 84.10±2.95%,P<0.001）,细胞内ROS水平（P<0.001,P<0.01）及AMP/ATP比值（P<0.001,P<0.001）明显更高,细胞内AMPK（p Thr172）蛋白表达水平明显更高（P<0.01,P<0.01）;加入抗氧化剂NAC后,CAB+ACT001+NAC组的细胞存活率（51.10±5.36%vs 52.07±5.61%,P>0.05）、细胞内ROS水平（P>0.05）、AMP/ATP比值（P>0.05）以及AMPK（p Thr172）蛋白表达水平（P>0.05）类似于CAB组。对于MMQ细胞,BRC+ACT001组较BRC组及ACT001组细胞存活率明显更低（52.53±5.05%vs 69.83±1.17%,P<0.01;52.53±5.05%vs 81.80±1.10%,P<0.01）,细胞内ROS水平（P<0.001,P<0.01）及AMP/ATP比值（P<0.01,P<0.05）明显更高,细胞内AMPK（p Thr172）蛋白表达水平明显更高（P<0.01,P<0.01）;加入抗氧化剂NAC后,BRC+ACT001+NAC组的细胞存活率（75.60±4.55%vs69.83±1.17%,P>0.05）、细胞内ROS水平（P>0.05）、AMP/ATP比值（P>0.05）以及AMPK（p Thr172）蛋白表达水平（P>0.05）类似于BRC组。结论:ACT001可通过提高细胞内ROS水平,从而上调细胞内AMP/ATP比值,进而激活AMPK,诱导DA耐药性垂体泌乳素腺瘤细胞死亡。第二部分:ACT001激活AMPK抑制m TOR通路逆转GH3细胞对CAB耐药的机制目的:验证ACT001通过激活AMPK,抑制m TOR信号通路,诱导CAB耐药的GH3细胞增加细胞自噬。方法:将GH3细胞分为对照组、CAB处理组、ACT001处理组、CAB+ACT001处理组、CAB+A-769662处理组以及CAB+ACT001+Compound C处理组。通过CCK8比色法及细胞克隆形成实验比较不同药物处理后细胞增殖能力的改变。通过Western Blot测定AMPK、m TOR负性调控蛋白（Raptor和结节性硬化症复合体2（Tuberous sclerosis complex,TSC2））、细胞自噬相关蛋白（Beclin-1和UNC51样激酶1（UNC51 like kinase 1,ULK1））以及自噬标记物（轻链蛋白3Ⅰ（light chainⅠ,LC3Ⅰ）、轻链蛋白3Ⅱ（light chainⅡ,LC3Ⅱ））表达水平。通过透射电镜观察不同药物处理的各组细胞内自噬小体数量。通过慢病毒构建AMPK被沉默的GH3细胞系来检测药物对该细胞系的作用。结果:（1）CAB+ACT001组较CAB组及ACT001组细胞存活率明显更低（35.30±3.33%vs 59.63±1.76%,P<0.001;35.30±3.33%vs 84.10±3.90%,P<0.001）;加入AMPK激动剂A-769662后,CAB+A-769662组的细胞存活率与CAB+ACT001组相似（35.70±3.86%vs 35.30±3.33%,P>0.05）;加入AMPK抑制剂Compound C后,CAB+ACT001+Compound C组细胞存活率与CAB组相似（57.23±9.86%vs 59.63±1.76%,P>0.05）。（2）CAB+ACT001组较CAB组及ACT001组的AMPK（p Thr172）、m TOR负性调控蛋白Raptor（p Ser792）和TSC2（p Ser1387）表达更高,促进自噬的Beclin-1（p Ser14）、ULK1（p Ser317）蛋白表达更高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也更高,抑制自噬的ULK1（p Ser757）蛋白表达更低;加入A-769662后,CAB+A-769662组的上述蛋白表达水平与CAB+ACT001组相似;加入Compound C后,CAB+ACT001+Compound C组的上述蛋白表达水平与CAB组相似。（3）CAB+ACT001组较CAB组及ACT001组细胞内自噬小体数目明显更多（P<0.001,P<0.001）;加入A-769662后,CAB+A-769662组细胞内自噬小体数目与CAB+ACT001组相似（P>0.05）;加入Compound C后,CAB+ACT001+Compound C组细胞内自噬小体数目与CAB组相似（P>0.05）。（4）对于AMPK被沉默的GH3细胞,CAB+ACT001+A-769662组细胞存活率较CAB+ACT001组明显更低（40.53±3.56%vs 71.77±3.35%,P<0.001）;加入CAB+ACT001的AMPK被沉默的GH3细胞其细胞存活率明显高于加入CAB+ACT001的正常GH3细胞（71.77±3.35%vs 35.20±2.98%,P<0.001）。结论:ACT001可通过激活AMPK进而抑制m TOR信号通路,诱导CAB耐药的GH3细胞增加细胞自噬,逆转耐药。第三部分:ACT001激活AMPK增强EGR1通路逆转MMQ细胞对BRC耐药的机制目的:验证ACT001通过激活AMPK,增强EGR1信号通路,诱导BRC耐药的MMQ细胞增加细胞凋亡。方法:将MMQ细胞分为对照组、BRC处理组、ACT001处理组、BRC+ACT001处理组、BRC+A-769662处理组以及BRC+ACT001+Compound C处理组。通过CCK8比色法比较不同药物处理后各组细胞增殖能力的变化。通过Western Blot测定AMPK、EGR1、细胞凋亡相关蛋白（BAX、Bcl-2）以及Casepase-3蛋白表达水平。通过流式细胞仪检测不同药物处理后MMQ细胞凋亡发生率。通过慢病毒构建AMPK被沉默的MMQ细胞系来检测药物对该细胞系的作用。结果:（1）BRC+ACT001组较BRC组及ACT001组细胞存活率明显更低（49.40±5.46%vs 69.50±3.30%,P<0.01;49.40±5.46%vs 81.00±2.09%,P<0.01）;加入AMPK激动剂A-769662后,BRC+A-769662组细胞存活率与BRC+ACT001组相似（49.10±4.52%vs 49.40±5.46%,P>0.05）;加入AMPK抑制剂Compound C后,BRC+ACT001+Compound C组细胞存活率与BRC组相似（73.83±3.97%vs 69.50±3.30%,P>0.05）。（2）BRC+ACT001组较BRC组及ACT001组的AMPK（p Thr172）、EGR1蛋白表达水平明显更高,且促进凋亡的BAX蛋白表达水平明显更高而抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达水平明显更低,凋亡标志物Casepase-3蛋白表达水平在BRC+ACT001组较BRC组及ACT001组也明显更高;加入A-769662后,BRC+A-769662组的上述蛋白表达水平与BRC+ACT001组相似;加入Compound C后,BRC+ACT001+Compound C组的上述蛋白表达水平与BRC组相似。（3）BRC+ACT001组较BRC组及ACT001组细胞凋亡水平明显更高（P<0.001,P<0.001）;加入A-769662后,BRC+A-769662组细胞凋亡水平与BRC+ACT001组相似（P>0.05）;加入Compound C后,BRC+ACT001+Compound C组细胞凋亡水平与BRC组相似（P>0.05）。（4）对于AMPK被沉默的MMQ细胞,BRC+ACT001+A-769662组细胞存活率较BRC+ACT001组明显更低（43.13±1.40%vs 68.13±3.47%,P<0.001）;加入BRC+ACT001的AMPK被沉默的MMQ细胞其细胞存活率明显高于加入BRC+ACT001的正常MMQ细胞（68.13±3.47%vs 35.13±2.00%,P<0.001）。结论:ACT001可通过激活AMPK增强EGR1信号通路,诱导BRC耐药的MMQ细胞增加凋亡,逆转耐药。第四部分:裸鼠体内实验验证ACT001激活AMPK与CAB联用逆转垂体GH3腺瘤耐药目的:通过裸鼠皮下成瘤实验,在体内验证ACT001激活AMPK,逆转垂体GH3腺瘤对CAB耐药（因MMQ细胞在免疫抑制的小鼠中不能成瘤,故仅使用GH3细胞进行裸鼠皮下成瘤实验）。方法:建立裸鼠GH3细胞移植瘤模型,将裸鼠分为对照组、CAB处理组、ACT001处理组、CAB+ACT001处理组、CAB+ACT001+NAC处理组。观察各组裸鼠皮下移植瘤的生长情况,免疫组化染色检测AMPK（p Thr172）、Raptor（p Ser792）及Beclin（p Ser14）的阳性表达水平。结果:CAB+ACT001组裸鼠肿瘤较CAB组及ACT001组肿瘤体积较小（409.67±87.02mm~3 vs 1392.10±348.16mm~3,P<0.001;409.67±87.02mm~3 vs 1623.00±162.52mm~3,P<0.001）,CAB+ACT001+NAC组裸鼠肿瘤大小与CAB组相似（1429.00±429.64mm~3 vs 1392.10±348.16mm~3,P>0.05）。免疫组化结果显示:CAB+ACT001组裸鼠肿瘤组织较CAB组及ACT001组AMPK（p Thr172）、Raptor（p Ser792）和Beclin（p Ser14）染色阳性率更高,CAB+ACT001+NAC组的上述蛋白染色阳性情况与CAB组相似。结论:ACT001在体内可通过激活AMPK逆转垂体泌乳素腺瘤对CAB耐药。