叶片衰老是一个复杂的生物学过程,通常发生在植物发育的最后阶段,由环境信号和多基因网络参与调控。类病变突变体能自发形成类似于过敏反应的坏死斑,且大多数突变体能表现出对一种或多种病原菌的抗性,是一类研究植物防御反应机制的理想材料。尽管目前对植物叶片衰老和防御反应的分子机理有了一定的研究,但其分子调控网络仍有待进一步丰富和解读,从而为开展水稻分子设计育种,培育抗衰老高产新品种打下基础。本研究通过EMS诱变粳稻品种云稻32(Y32)种子获得两个稳定遗传的类病变早衰突变体,分别命名为:lmes3(lesion mimic and early senescence 3)和 lmes4(lesion mimic and early senescence 4)。经表型鉴定、基因定位与克隆、抗性鉴定及功能分析等相关研究,主要结果如下:1、lmes3突变体苗期地上部表现正常,但根系发育受阻;分蘖早期叶片就出现铁锈斑表型,随着植株的生长,斑点数目增加;进入孕穗期,叶尖开始枯黄,出现早衰表型;抽穗期枯黄从叶尖开始沿着叶边一直延续到叶的底部;成熟期斑点连片存在,衰老加速,叶片全部枯黄,整个植株呈黄褐色直至提前枯死。在苗期和分蘖期对植株进行低温处理时,能诱导lmes3突变体表现出早衰现象。lmes4突变体苗期地上部也表现正常,在分蘖早期叶片出现类似于过敏反应(hypersensitive response,HR)的类病斑,同时整片叶片叶脉间的叶肉部分出现失绿黄化症状,而叶脉仍然保持绿色;到抽穗期时,突变体下部叶片叶尖枯黄加剧,上部功能叶片叶尖开始枯黄并伴有水渍状斑点,整片叶片叶脉间的失绿黄化症加重;成熟期叶尖完全枯黄,叶脉间黄化症连片出现,并从叶尖一直延续到叶中部,直到整片叶片三分之一以上完全枯死;成熟后20d,突变体叶尖完全枯死,但整片叶片还有部分保持绿色,叶片表现为过早衰老。与野生型相比,lmes3突变体的抽穗期晚3d,lmes4突变体的抽穗期晚2d,lmes3和lmes4突变体的株高、结实率及千粒重均显著性降低,而穗长、有效穗数、每穗粒数差异不明显。2、遗传分析表明,lmes3和lmes4突变表型均受单隐性核基因控制。利用图位克隆法,最终将LMES3基因定位在第5染色体P27和P33之间约55kb的物理区间内;将LMES4基因定位在第1染色体M25和M48之间约48kb的物理区间内。通过RGAP(Rice Genome Annotation Project)网站上的注释查询,发现LMES3基因定位的区间包含8个开放阅读框(open reading frame,ORF),测序发现第2开放阅读框上发生一个G到A的单碱基突变,造成了编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)替换成了赖氨酸(Lys),经转基因互补和过表达实验证实其就是LMES3的候选基因。LMES4基因定位的区间包含7个开放阅读框,测序发现第6开放阅读框上发生一个G到A的单碱基突变,造成编码氨基酸由色氨酸(Try)替换成了终止子,导致翻译提前终止,最终造成蛋白质功能缺失。3、LMES3和LMES4为两个未报道控制叶片早衰的新基因。组织特异表达分析表明LMES3基因在各个组织器官均有表达,其中在茎中表达量最高。亚细胞定位分析表明,LEMS3蛋白最终定位于细胞膜上。4、叶绿素含量的下降是叶片衰老的重要生理指标。相关测定结果显示,lmes3和lmes4突变体叶片中叶绿素的含量较野生型均显著下降,这表明两个突变体在生理水平上均已经开始早衰。衰老诱导的SGR(STAY GREEN)基因在调节叶绿素降解代谢的过程中发挥着重要的作用,而 qRT-PCR(quantitative real-time,PCR)也证明 SCG 在lmes3和lmes4突变体的叶片中的表达量均显著上调。此外,lmes3和lmes4突变体的离体叶片在黑暗诱导下均比野生型衰老更为迅速和剧烈,这表明LMES3和LMES4基因的突变加快了叶片衰老。5、叶肉细胞的超微结构显示,lmes3和lmes4突变体的叶绿体中类囊体排列比较紊乱,片层排列不规则,嗜锇颗粒的数量增多,体积增大,颜色加深,且lmes4中叶绿体数目有所减少。这些结果表明LMES3和LMES4基因突变影响了叶绿体的发育,从而导致叶绿素含量显著下降,叶片提前衰老。扫描电镜观察发现lmes4叶片单位叶面积内气孔和周边排列的硅质化爪状突起的数目减少,表明其水分蒸腾作用下降,推测一些随水份吸收和流动的矿质盐类(无机盐)运输减弱,进而导致叶片正常生理活动受阻,造成叶片早衰。6、组织化学染色表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)——超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)在lmes3和lmes4突变体叶片中积累,叶片丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加,这些结论充分表明lmes3和lmes4突变体叶片已经发生早衰。为了探索lmes3和lmes4突变体中ROS的代谢过程,检测了野生型和突变体中抗氧化酶过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的酶学活性,其中POD和SOD活性在lmes3和lmes4突变体的叶片中显著升高,而CAT活性则显著降低。POD和SOD活性的升高表明lmes3和lmes4突变体可能在积极地响应H2O2和O2-的积累,而lmes3和lmes4突变体叶片中CAT活性的降低可能不足以清除这些额外的H2O2,致使H2O2大量积累。积累的ROS在lmes3和lmes4突变体的叶片早衰和防御反应过程中发挥着重要的作用。7、qRT-PCR分析表明,在lmes3和lmes4突变体叶片中,衰老相关的标志基因Osl2和Osl85,相关的转录因子OsWRKY23和OsNAC2表达均上调,光合系统相关基因rbcS、lhcA、lhcB表达均下调。这些结果在分子水平上证实了 lmes3和lmes4突变体的叶片发生了早衰。8、接种白叶枯病菌浙173(Z173)后,野生型Y32植株表现出典型的白叶枯病发病症状,而突变体植株却显著提高了对白叶枯病的抗性。qRT-PCR分析发现防御反应相关基因PR1a、PBZ1和OsWRKY45的表达量在lmes3和lmes4突变体叶片中均显著上调。这些结果表明,LMES3和LMES4基因突变可激活植株防御反应,进而增强抗白叶枯病的能力。上述结果表明LMES3和LMES4基因突变可导致叶片早衰和防御反应的产生,ROS(02-和H2O2)可能参与了这两个生物学过程。其中,水稻LMES3的编码蛋白是一个多功能蛋白,在叶片早衰、防御反应及非生物胁迫途径中扮演着重要作用,其生化作用机制仍有待进一步研究。