BmNPV编码的circRNA的功能及下调m~6A相关基因的表达对病毒增殖的影响

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随着高通量技术的发展,越来越多的circRNA被发现并鉴定,并且被证明具有与miRNA和蛋白质结合、调控基因转录、翻译蛋白白等功能,在细胞增殖分化、生长发育、疾病发生和发展等过程中发挥重要作用。m6A修饰作为一种最普遍的甲基化修饰方式,近年来,已发现m6A可以参与调控病毒增殖复制。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyheadrovirus,BmNPV)引起的家蚕血液型脓病给养蚕业带来巨大的损失,至今还没有关于BmNPV转录产物形成circRNA以及m6A修饰对BmNPV增殖复制调控的报道。本研究通过circRNAs高通量技术比较了BmNPV感染后的中肠和正常中肠中家蚕circ RNAs表达,共发现353个circRNAs的表达存在显著差异,相比较于正常中肠,在感染BmNPV的中肠中241个circRNA表达上调,1 12个circRNA表达下调。GO和KEGG的分析显示,家蚕来源的circRNA可能通过与miRNA互作参与调控细胞凋亡、内吞作用和泛素化等过程。进一步将BmNPV感染家蚕的中肠circRNA高通量测序数据与BmNPV基因组比对,发现了 BmNPV来源的circRNA。基于发散型引物PCR和Sanger测序,鉴定到 3 种 BmNPV 来源的 circRNA,命名为 circ003、circ004、circ010。定量PCR检测结果表明,在BmNPV感染12h后,circ003开始表达,并逐渐积累,其亲本基因lef-6在感染6h后开始表达,circ003能以剂量依赖方式抑制BmNPV增殖,促进家蚕培养细胞BmN从G1期进入S期。circ004在BmNPV感染12h后开始产生,其亲本基因odv-e66的表达也能在同时期检测到,上调circ004的表达水平可激活家蚕先天免疫相关基因Dicer2的表达。circ010在BmNPV感染6h后产生,其亲本基因odv-e18表达也能同时检测到。细胞免疫荧光结果显示,这3种circRNA 均可与 NF90/NF110、Rig-1共定位。circRNA-pull down 结果显示,circ010有可能通过与蛋白互作发挥功能。这些结果表明BmNPV可表达功能性circRNAs,对调节病毒的感染进程、在病毒与宿主的互作中发挥作用。m6A修饰对BmNPV增殖的影响还不明。通过RNAi降低与m6A有关的METTETL3、MTL14、YTHDF3基因的表达水平,发现其对BmNPV的Bm59基因的表达下调,而Western blot的结果显示,METTL3表达下调导致odv-e25蛋白水平上升,YTHDF3表达下调引起odv-e25蛋白水平下调,推测细胞甲基化水平的影响病毒的增殖。
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