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本试验以大鼠小肠上皮细胞IEC-6为试验模型,探究了三种不同水平锌源(纳米氧化锌、氧化锌和硫酸锌)对产肠毒性大肠杆菌(ETEC, K88菌株)的生长和在小肠上皮细胞上粘附的影响,及这三种锌对产肠毒性大肠杆菌侵染的小肠上皮细胞免疫调节功能的影响。本研究共包括两个试验：试验一、不同锌源对产肠毒性大肠杆菌的生长和粘附的影响1、产肠毒性大肠杆菌在小肠上皮细胞上侵染模型的建立在小肠上皮细胞(IEC-6,104个细胞/孔)中分别添加5个不同水平(每孔中含0、1×102、1×104、1×106、1×108CFU细菌)的产肠毒性大肠杆菌(ETEC,K88菌株),分别处理1.5、3、4.5h后测定CCK-8 OD值。试验结果表明：所有浓度的产肠毒性大肠杆菌均能显著降低IEC-6的CCK-8 OD值(P<0.05),并且具有时间和剂量效应。本试验通过选择1×106 CFU产肠毒性大肠杆菌处理组,确定感染复数(细菌与细胞的比值)为100,作为后续试验加入产肠毒性大肠杆菌浓度的依据。感染复数为100,作用时间为3h时,细胞活力与对照组和1.5h处理组相比,均显著下降,同时,此时大量细菌粘附在细胞周围,细胞周围未出现大量的空白区域。由此,建立了产肠毒性大肠杆菌在小肠上皮细胞上的侵染模型。2、不同锌源对产肠毒性大肠杆菌生长和在小肠上皮细胞上粘附的影响分别在含有产肠毒性大肠杆菌的培养液中添加0、6、12、24、48、96μmol/L的纳米氧化锌、氧化锌和硫酸锌,其中,对照组为不加锌的产肠毒性大肠杆菌处理组,总处理时间为24h,每隔1.5个小时测定一次吸光度。研究结果表明：与对照组相比,6、12、2、48μmol/L纳米氧化锌处理组,所有浓度氧化锌和硫酸锌处理组,在处理时间为1.5h时,处理组吸光度均低于对照组(P<0.05)。48、96μmol/L纳米氧化锌和96μmol/L硫酸锌在24h时,与对照组相比吸光度显著降低(P<0.05)。所有浓度氧化锌处理组在24h时的吸光度与对照组相比均无显著性的变化(P>0.05)。这说明纳米氧化锌、氧化锌和硫酸锌在一定浓度均具有一定的抑菌作用,但锌对产肠毒性大肠杆菌生长的影响主要是通过作用于产肠毒性大肠杆菌不同生长时段的结果。抑菌实验结果显示,加入三种锌与产肠毒性大肠杆菌连续作用24h后,并没有出现显著的抑菌圈,说明三种锌在连续作用24h后均没有抑制产肠毒性大肠杆菌的作用。这一结果也进一步支持了以上结果。与对照组相比,加入6μmol/L纳米氧化锌,6、12、24μmol/L的氧化锌和硫酸锌对产肠毒性大肠杆菌在IEC-6细胞上粘附的作用具有不同程度的促进作用。而加入12、24、48、96μmol/L纳米氧化锌后,粘附在IEC-6细胞上的产肠毒性大肠杆菌数减少,其中,24、48、96μmol/L的纳米氧化锌显著抑制了产肠毒性大肠杆菌在小肠上皮细胞上的粘附(P<0.05)。试验二、不同锌源对产肠毒性大肠杆菌侵染的小肠上皮细胞IEC-6免疫调节功能的影响。添加6个不同水平(0、6、12、24、48、96μmol/L)的三种锌源(纳米氧化锌、氧化锌和硫酸锌)和产肠毒性大肠杆菌(ETEC,K88菌株,感染复数为100)作用3h后测定紧密连接蛋白和免疫调节相关基因的表达量。以不添加锌和产肠毒性大肠杆菌的处理组为正常对照组,不添加锌源的产肠毒性大肠杆菌处理组为阴性对照组。结果表明：添加产肠毒性大肠杆菌后,Claudin-1、ZO-1和Occludin mRNA表达量显著降低(P<0.05)。与ETEC处理组相比,添加24μmol/L纳米氧化锌后Claudin-1和Occludin mRNA表达量增加并达到显著水平(P<0.05)。细胞用96μmol/L的纳米氧化锌处理后,ZO-1的基因表达水平显著低于ETEC组(P<0.05)。ETEC处理组与6、12、24、48μmol/L硫酸锌处理组的Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA的表达量相比,没有显著性差异(P>0.05)。在添加量为24μmol/L时,纳米氧化锌处理组的Claudin-1和Occludin基因表达量显著低于氧化锌和硫酸锌处理组。说明24μmol/L的纳米氧化锌能显著降低产肠毒性大肠杆菌诱导的紧密连接的破坏,且效果优于氧化锌和硫酸锌；而加入量为96μmol/L时,则加速了紧密连接的破坏。ETEC处理组显著升高了IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达量(P<0.05)。说明加入产肠毒性大肠杆菌后诱发了肠上皮细胞的炎症反应。24μmol/L纳米氧化锌显著降低了由ETEC诱导的IEC-6中IL-1β、TNF-α mRNA表达量(P<0.05)。当加入浓度为96μmol/L时,IL-1β、 IL-6和TNF-a mRNA显著高于ETEC处理组(P<0.05)。添加6、12、24、48μmol/L纳米氧化锌和12、24、48、96μmol/L氧化锌处理组显著提高了TGF-β mRNA表达量(P<0.05)。说明适当浓度的锌能够缓解由产肠毒性大肠杆菌诱发的炎症反应,但高浓度锌则加速了肠上皮细胞的炎症反应,同样也说明,细胞因子对三种锌源的敏感度各不相同,这意味着三种锌在炎症过程中的作用方式可能存在差异。综上所述：产肠毒性大肠杆菌对小肠上皮细胞IEC-6细胞活性的影响有时间和剂量效应。当感染复数为100,作用时间为3h时,可建立产肠毒性大肠杆菌在小肠上皮细胞IEC-6上的侵染模型。纳米氧化锌、氧化锌和硫酸锌对产肠毒性大肠杆菌的生长具有不同程度的抑制作用,并且这种抑制作用因加入锌的存在形式、浓度和作用时间而存在很大的差异。当加入96μmol/L,三种锌对产肠毒性大肠杆菌在小肠上皮细胞上的粘附均具有抑制作用,其中,纳米氧化锌的作用效果最为明显。另外,24μmol/L的纳米氧化锌具有减缓产肠毒性大肠杆菌诱导的小肠上皮细胞紧密连接的破坏和炎症反应,但96μmol/L的纳米氧化锌和硫酸锌则加速了紧密连接的破坏和炎症产生。