钙反应性反式激活子(calcium responsive transactivator,CREST)是一种在脑内较高水平表达的核蛋白,可通过钙离子依赖性反式激活作用诱导基因转录,在促进神经元树突的生长和分支发育,以及维持成熟神经元的形态和功能方面具有重要作用。CREST表达在胚胎晚期开始出现,出生后早期达到高峰,在成年期维持在较低水平。CREST仅表达在皮质板的分裂后神经元内,而在脑室带具有增殖能力的成神经细胞无表达。CREST基因敲除小鼠的神经元树突生长发育异常,树突平均长度及分支都显著降低。我们的前期研究发现,在诱导小鼠成神经瘤母细胞(N2a细胞)的分化过程中,CREST的表达水平显著增高;过表达CREST可通过促进p53的乙酰化从而稳定p53和促进p53的活性,上调p21的表达,抑制视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)的磷酸化修饰进而抑制周期蛋白的表达,导致细胞周期阻滞,并促进N2a细胞的突起生长,上调多种神经元分化标志物的表达。用低浓度血清诱导分化培养的小鼠神经干细胞,NeuN表达逐渐增强的细胞中CREST免疫反应性也逐渐增强;细胞内CREST蛋白和mRNA水平随着诱导分化时间的延长而逐渐增加。沉默CREST表达的神经干细胞,用低浓度胎牛血清诱导分化后,NeuN阳性的细胞数目减少,表达胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的细胞数量增加,神经元树突、轴突发育标志物及神经元成熟标志物的mRNA表达水平均明显低于对照细胞。由此表明,CREST的表达与神经细胞分化过程的调节相关。但是,CREST调节神经元分化的机制尚不明确。CREST诱导相关基因的转录表达与其募集组蛋白乙酰化酶CBP和p300有关。CBP和p300可通过增强p53的乙酰化修饰激活神经元分化标志物的表达和促进神经元的突起生长。为了明确CREST是否通过CBP和/或p300实现对p53的乙酰化修饰而激活p53下游基因的表达,实现促进神经元分化作用,本研究首先在进一步证实CREST与神经元分化关系的基础上,解析CREST与CBP/p300和p53之间的相互作用关系,对CREST促进神经元分化的机制进行深入研究。1.CREST调节神经元分化为了进一步明确CREST与神经元分化的关系,本研究首先检测了无血清培养诱导N2a细胞对CREST表达的影响。将N2a细胞无血清培养不同时间后,应用Real-Time PCR、Western blot和免疫荧光检测显示,N2a细胞内CREST的mRNA和蛋白水平随诱导分化呈时间依赖性增高,核内CREST免疫反应性随诱导分化时间的延长而逐渐增强。对以低浓度(5%)胎牛血清培养进行分化诱导的小鼠胚胎神经干细胞进行定量PCR检测证实,CREST mRNA水平呈诱导分化时间依赖性升高,免疫荧光检测显示,神经干细胞标志物nestin免疫反应性和阳性细胞比例随着分化诱导时间的延长而显著降低,CREST免疫反应性和阳性细胞比例则随着分化诱导时间的延长而逐渐上升。由此表明,神经细胞分化诱导能上调CREST的表达。进一步对改变N2a细胞内CREST表达水平与神经元分化标志物表达关系的检测显示,在过表达CREST的N2a细胞中,分别用Western blot和免疫荧光技术检测神经元突起标志物(成熟神经元特异性骨架标志物β-Tub3、神经元树突标志物Map2和神经元轴突标志物NF-H)的表达和分布,结果显示,过表达CREST后,以上三种神经元突起标志物的蛋白水平均显著增加,同时高水平分布于N2a细胞突起中。进一步对成熟神经元标志物(β-Tub3、NeuN、NeuroD),树突标志物(Map2、Dbn1)和轴突标志物(NF-H、GAP43、Syn1)的mRNA表达水平进行Real-Time PCR检测证明,过表达CREST显著促进这些基因的mRNA表达。在无血清培养诱导分化的N2a细胞中,沉默CREST则会阻断过表达CREST对这些基因mRNA表达的上调。由此表明,CREST能够普遍性上调N2a细胞中神经元分化相关基因的表达。2.CREST通过其氨基端与p53中间区域相互作用我们的前期实验发现CREST可促进p53的乙酰化。为了揭示CREST调节p53乙酰化的机制,对CREST与p53的结合特性及二者结合的分子区域进行了检测。免疫荧光双标分析显示,在未分化诱导的N2a细胞中,仅见少量的CREST与p53共定位,而以无血清培养诱导分化的N2a细胞中,CREST和p53免疫反应性均明显增强,且二者之间的以颗粒状存在的共定位比例明显增加。免疫共沉淀检测显示,在出生后一周小鼠的大脑皮质裂解物和无血清培养诱导分化48 h的N2a细胞裂解物中,CREST与p53可相互结合;在无血清培养诱导分化的N2a细胞中,CREST与p53的结合能力随分化诱导时间的延长而增强。进一步利用pEGFP-CREST和mCherry-p53以及二者各自的结构缺失突变体质粒对CREST与p53结合的分子区域分析证明,CREST通过其氨基端(1-148氨基酸)与p53的中间区域(100-256氨基酸)相互结合。由此提示,CREST可能通过与p53的相互作用调节其乙酰化。3.CREST通过促进p53 K382位点乙酰化修饰上调其下游神经元分化相关基因的表达和促进神经细胞分化p53活化而上调神经元分化相关基因转录表达主要通过其K373和K382两个位点的乙酰化修饰增强来实现。为了明确CREST促进神经元分化的机制,我们在进一步检测了CREST对p53乙酰化的影响及其在神经元分化中的作用。Real-Time PCR和Western blot检测发现,过表达CREST不改变p53的mRNA表达,但能增加p53蛋白水平。采用放线菌酮抑制核糖体翻译后,检测p53在不同时间点的代谢稳定性发现,过表达CREST后,p53的代谢稳定性显著增强。对p53的K373和K382两个乙酰化位点的乙酰化水平检测表明,过表达CREST能促进p53K382位点的乙酰化修饰,同时伴有p53下游基因p21 mRNA和蛋白的上调,但对K373位点的乙酰化无影响;在过表达CREST促进N2a细胞的分化过程中,免疫荧光染色显示p53入核比例显著增加。p53底物序列荧光素酶报告基因检测显示,过表达CREST在无分化诱导条件下也能显著增强p53促进其靶基因转录的活性,而沉默CREST则阻断无血清培养诱导分化所致的p53促进其靶基因转录的活性增强。由此进一步证实CREST可通过增强p53 K382位点的乙酰化修饰而增强其稳定性和促进靶基因转录活性。经乙酰化修饰而活化的p53通过与神经元分化相关基因启动子区的相互作用而激活这些基因的转录,进而引起神经细胞分化。为了明确CREST促神经细胞分化的作用是否通过该途径实现,首先应用染色质免疫共沉淀结合Real-Time PCR检测了过表达CREST对p53与Map2、GAP43、Coronin 1b、Rab 13、TrkA、Wnt7b等基因启动子区相互作用的影响。结果表明,过表达CREST能显著增强p53与上述神经元分化相关基因启动子区相互作用。进一步的Real-Time PCR检测显示,沉默p53可显著抑制过表达CREST对上述神经元分化相关基因表达的上调作用;利用标记神经元突起的β-Tub3免疫荧光染色发现,沉默p53或过表达点突变p53 K382R均能显著抑制过表达CREST引起的神经突起生长;Western blot分析表明,沉默p53能抑制过表达CREST所致的神经元分化标志物Map2、GAP43、Coronin 1b、Rab 13、β-Tub3、NF-H、NeuroD等的表达上调。4.CREST通过p300增强p53 K382位点乙酰化上调神经元分化相关基因转录和促进神经细胞分化CREST本身并不具有乙酰转移酶的活性,但与对p53 K382位点具有乙酰化作用的组蛋白乙酰转移酶CBP和p300具有相互作用。为了明确CREST是否通过CBP和/或p300实现对p53的乙酰化修饰而促进神经细胞分化,我们首先对N2a细胞分化过程中CREST、CBP、p300和p53之间的相互作用关系进行了分析。同时检测了沉默CBP、p300和p53对CREST促神经元分化作用的影响。蛋白质免疫共沉淀分析显示,过表达CREST能促进p300而非CBP与p53的结合;免疫荧光三标染色显示,与未用无血清培养分化诱导的N2a细胞比较,在无血清培养分化诱导的N2a细胞中可见更多CREST、p300和p53共定位分布的CREST-p300-p53小体。由此可见,神经元分化过程中上调的CREST可促进p300与p53的相互作用。进而对CBP或p300在CREST通过调节p53乙酰化而促进神经细胞分化中的作用分析显示,在N2a细胞中,沉默CBP对过表达CREST上调p53 K382乙酰化、促进突起生长和上调神经细胞分化相关基因的蛋白表达无明显影响,但沉默p300则可减弱过表达CREST上调p53K382乙酰化、促进突起生长和上调神经细胞分化相关基因的蛋白表达的作用。因此,p300在CREST促进p53 K382的乙酰化进而促神经细胞分化过程中发挥重要作用。结论:在神经细胞分化过程中,CREST的表达水平增加;高表达的CREST通过大量募集p300和p53,实现CREST-p300-p53小体的组装,同时介导p300对p53 K382位点的乙酰化修饰,导致p53对下游神经元分化相关基因的转录激活,从而促进神经细胞分化。