血管内皮生长因子受体2(Flk-1/KDR)胞内酪氨酸激酶段具有较强的磷酸化活性,成为血管内皮生长因子(VEGF)介导新生血管形成的重要特异性受体。新生血管的形成对恶性肿瘤的生长是必不可少的因素,因而以KDR酪氨酸激酶为靶点进行药物设计和筛选已成为抗肿瘤血管生成的重要方略。本研究主要目的是在原核体系中表达KDR酪氨酸激酶,并进行纯化,在此基础上以纯化的重组蛋白为靶位,采用免疫学方法建立KDR酪氨酸激酶抑制剂筛选模型并进行初步应用。首先,以pQE30为载体,在E.coli M15中成功表达了KDR酪氨酸激酶。研究结果表明,可溶性重组蛋白的最适诱导表达条件为诱导温度22℃,诱导时间3h,IPTG浓度为0.5mmol/L。采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化,其纯度和浓度均达到了实验要求。SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量约为36kDa,与预计的一致。Western Blot鉴定分析结果表明它与抗Flk-1和抗His抗体均发生特异反应,说明该重组蛋白为KDR酪氨酸激酶。Western Blot进一步分析表明本研究表达的KDR酪氨酸激酶具有自磷酸化活性。以纯化的KDR酪氨酸激酶为靶位,采用酶免方法及光激化学发光技术建立药物筛选模型,并对其反应条件进行优化。在此基础上选取文献已报道的KDR酪氨酸激酶抑制剂SU11248和PTK787作为对照,验证了所建立的药物筛选模型的可行性。同时对两种不同方法建立的药物筛选模型进行反应动力学及相关性的比较,结果表明两种方法相关性较好,但采用AlphaScreen方法建立的模型采用均相反应系统,反应速度较快、免洗、误差小等,更适用于高通量药物筛选的应用。最后选取具有抗肿瘤活性并由本实验室合成的某含钴元素的化合物对AlphaScreen方法建立的模型进行应用,结果表明该化合物对KDR酪氨酸激酶抑制作用良好。