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目的:观察Pokemon在人乳腺癌MCF-7细胞中对Smad4表达的影响,并初步探究其相关分子机制。方法:实验分为二部分。第一部分:1)以体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,通过转染空载体质粒及Pokemon表达质粒分别作为对照组和实验组,用Q-PCR、Western Blot及免疫荧光分别从核酸水平、蛋白水平及形态学三个方面检测Pokemon对Smad4表达的影响;2)以体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,研究Pokemon对Smad4启动子活性的影响。通过瞬时转染空载体质粒作为对照组,瞬时转染Pokemon表达质粒作为实验组,然后应用双荧光素酶报告基因活性实验分析对照组和实验组的Smad4启动子的活性。第二部分:1)以体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,通过瞬时转染空载体质粒及Pokemon表达质粒分别作为对照组和实验组,以及培养稳定高表达Pokemon的MCF-7细胞,然后应用流式细胞术检测对照组和实验组的乳腺癌干样细胞数目的比率;2)以体外培养的MDA-MB-231细胞为研究对象,通过瞬时转染空载体质粒和Pokemon表达质粒分别作为对照组和实验组,应用流式细胞术检测对照组和实验组的乳腺癌干样细胞数目的比率。结果:第一部分:1.Pokemon在人乳腺癌MCF-7细胞抑制Smad4的表达。通过在MCF-7细胞中瞬时转染空载体质粒及Pokemon表达质粒:1)Q-PCR实验结果显示:Pokemon抑制Smad4 m RNA的转录(p<0.01);2)免疫荧光实验结果显示:Pokemon抑制Smad4蛋白的表达(p<0.05);3)Western Blot实验结果显示:Pokemon抑制Smad4蛋白的表达(p<0.05)。4)在稳定高表达Pokemon的MCF-7细胞中,Western Blot实验结果显示:Pokemon抑制Smad4蛋白的表达(p<0.05)。2.Pokemon在人乳腺癌MCF-7细胞中抑制Smad4启动子的活性。1)验证由本实验构建的3个p GL4.10-Smad4启动子片段在MCF-7细胞中具有转录活性。双荧光素酶报告基因活性实验结果显示:与转染p GL4.10相比,p GL4.10-Smad4各组的荧光比值明显增高(p GL4.10-Smad4pp1 p<0.001,p GL4.10-Smad4pp2 p<0.05,p GL4.10-Smad4pp3 p<0.05);2)研究Pokemon在MCF-7细胞中对p GL4.10-Smad4启动子片段活性的影响。双荧光素酶活性实验结果显示:在3个转染了不同长度的p GL4.10-Smad4启动子片段组中,与对照组相比,Pokemon高表达组的Smad4启动子活性均明显下调(p GL4.10-Smad4pp1 p<0.05、p GL4.10-Smad4pp2 p<0.001、p GL4.10-Smad4 p<0.05)。说明Pokemon在MCF-7细胞中抑制Smad4启动子的活性。第二部分:1.Pokemon在人乳腺癌MCF-7细胞中下调BCSCs的比率:流式细胞术实验结果显示:Pokemon在MCF-7细胞中下调瞬转(p<0.05)及稳转细胞株(p<0.05)中的CD24-/CD44~+的细胞比率。2.Pokemon在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中下调BCSCs的比率:流式细胞术实验结果显示:Pokemon在MDA-MB-231细胞中下调CD24-/CD44~+(p<0.05)和CD49f~+/Ep CAM~+(p<0.05)的细胞比率。结论:1)Pokemon在人乳腺癌MCF-7细胞中可抑制Smad4的表达,其机制可能与Pokemon通过抑制Smad4启动子活性有关。2)Pokemon在人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中下调BCSCs的比率。