脓毒症是宿主的防御系统对入侵的病原微生物作出的过度炎症反应,发病率30％-70％,是ICU患者最主要的死亡原因,发生脓毒症的患者接近30％会发生器官功能障碍,其中肺脏是最早也是最容易受累的器官,ICU中脓毒症患者超过50％会发生急性肺损伤(acute lung-mjury,ALI),发生ALI的脓毒症患者死亡率增高。近年研究表明ALI与脓毒症具有相似的病理生理过程:宿主防御反应失控导致炎症反应发生,内皮细胞损伤,凝血系统活化,纤溶受到抑制以及纤维化的发生。2001年一项评价重症感染患者应用活化蛋白C(activated protein C,APC)疗效的全球性研究结果表明治疗组死亡率下降6.1％,是迄今唯一证实重症感染患者应用抗凝剂提高生存率的国际性研究,后期研究表明与APC复杂的抗凝、抗炎及抗凋亡作用有关。近年越来越多的证据表明炎症与凝血之间存在广泛的交叉对话,抗凝剂在治疗ALI中具有积极作用。　　 核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)作为一种核转录因子,负责200多种基因的转录,其中多种基因在脓毒症中发挥重要作用。细菌和细菌的成分如脂多糖可以通过多种信号途径使NF-κB活化,导致促炎因子的表达,如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α,白细胞介素(intedeukin,IL)-1β,IL-6,IL-8,IL-12及IL-18,并进一步活化NF-κB和其上游的信号分子,形成恶性循环使炎症反应扩大。因此,NF-κB在炎症反应过程中处于核心位置。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)细胞内信号转导途径在调解下游蛋白质表达及炎症介质生成中起到重要作用,其中p38 MAPK是MAPK家族成员之一,在炎症反应、调节细胞周期、细胞死亡、发育、分化及肿瘤的发生等过程中起到关键作用。　　 目的：　　 肝素是一种天然形成的氨基葡聚糖,作为一种有效的抗凝剂在临床应用已超过半个世纪的时间。在拯救脓毒症运动指南中推荐应用300-500U/h的普通肝素或低分子量肝素预防深静脉血栓形成。肝素的抗凝作用机制是提高了抗凝血酶的活性,从而强烈抑制凝血酶、活化的因子x的活性。近年来,一系列临床和基础研究表明肝素除了其抗凝特性外,还可以通过多种途径调节炎症反应。肝素抑制促炎因子的释放,包括IL-1β,IL-6,TNF-α。肝素抑制缺血再灌注损伤中NF-κB介导的炎症反应,并通过增加一氧化氮和前列环素的生成减少了内皮细胞功能障碍。在高动力性脓毒症中,肝素改善内皮细胞功能和血管反应性。然而,其抗炎作用和器官保护机制迄今仍不清楚。因此,本研究中我们试图探讨肝素在急性肺损伤动物模型中的抗炎作用,并对体外脂多糖刺激人肺微血管内皮细胞的抗炎作用及作用机制进行研究,探讨了不同浓度肝素的作用,从而在细胞水平探讨肝素在脓毒症中的作用机制。　　 材料与方法：　　 一、动物模型　　 48只健康清洁级雄性Wistar大鼠,体重200-250g,随机分成四组:正常对照组(n=12)、急性肺损伤组(n=12)、急性肺损伤应用低剂量普通肝素组(n=12)、急性肺损伤应用高剂量普通肝素组(n=12)。急性肺损伤组鼠尾静脉注射脂多糖6mg/kg,两个肝素组在注射脂多糖前15分钟分别经鼠尾静脉注射普通肝素100U/kg和300U/kg,正常对照组经鼠尾静脉注射等量生理盐水。　　 二、标本的采集与处理　　 各组于造模后6小时腹主动脉剖开处死动物,其中6只取左肺置于4％多聚甲醛中过夜,石蜡包埋,制作5gm组织切片,用于形态学观察、免疫组织化学检查;另外6只取左肺测定肺干湿重比,右肺下叶测定伊文思兰通透性。　　 三、细胞培养　　 人肺微血管内皮细胞购于上海拜力生物技术公司。生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养,每隔1-2天换液一次,取指数生长期细胞用于检测。　　 四、实验方法　　 (一)组织水平　　 1.肺脏组织形态学观察:H-E染色　　 2.肺脏血管通透性测定:伊文思兰(evans blue dyes,EBD)　　 3.肺脏干湿重比测定　　 4.免疫组织化学技术:细胞因子、粘附分子及NF-κB在肺脏组织的表达　　 (二)细胞水平　　 1.MTT法测定细胞活力,检测不同浓度肝素对细胞的保护作用　　 2.Real-time PCR法检测肝素对细胞因子和粘附分子mRNA水平的影响　　 3.Western Blot法检测肝素对p38 MAPK磷酸化的影响　　 4.Western-Blot法检测肝素对NF-κB活性的影响　　 五、统计学分析　　 所有计量资料数据以均数士标准差(X±SD)表示,在计算机上用SPSS13.0软件包处理,单因素多水平比较采用方差分析,两样本均数间比较采用独立样本t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、肺脏组织学研究　　 (一)肺脏组织病理改变　　 急性肺损伤组炎症反应明显,肺泡壁增厚,炎症细胞浸润,局部出血及血栓形成,肺泡塌陷,肺泡腔内见到渗出液。肝素治疗组肺脏结构改变减少,炎症细胞浸润减轻,高剂量肝素组作用更明显。　　 (二)肺脏干湿重比　　 急性肺损伤组肺脏干湿重比明显降低(0.224±0.02 vs.0.295±0.03,P＜0.01),肝素治疗使肺脏干湿重比增加,与急性肺损伤组比较有统计学差异(低剂量肝素组0.266±0.01 vs0.224±0.02,P＜0.05;高剂量肝素组0.273±0.01 vs.0.224±0.02,P＜0.05),但两个肝素组间没有差异。　　 (三)肺脏血管通透性　　 急性肺损伤组肺脏对EBD通透性增加(1.821±0.14 vs.0.723±0.16,P＜0.01),肝素治疗减轻了肺血管的通透性,与急性肺损伤组比较有统计学差异(低剂量肝素组1.362±0.17 vs.1.821±0.14,P＜0.05;高剂量肝素组1.215±0.31 vs.1.821±0.14,P＜0.01),但两个肝素组间没有差异。。　　 (四)免疫组织化学技术检测炎症介质及NF-κB在肺脏内皮细胞的表达　　 免疫组化显示正常肺组织仅在细胞浆及细胞间质有少量炎症介质的表达,急性肺损伤组在炎性细胞和微血管内皮细胞及细胞间质均可见炎症介质的大量表达,尤其IL-1β、ICAM-1、E-选择素表达明显,肝素治疗组表达明显减少,高剂量肝素组更明显。　　 二、细胞培养　　 (一)肝素减少脂多糖对内皮细胞活力的影响　　 肝素浓度大于50U/ml降低细胞活力,本实验中使用的肝素浓度对细胞没有毒性作用;脂多糖使细胞活力下降,肝素减少了脂多糖对细胞活力的影响。　　 (二)肝素减少炎症介质mRNA的表达　　 脂多糖刺激下,细胞内IL-1β、IL-6、ICAM-1、E-选择素mRNA水平明显增高,其中IL-1β、IL-6于2小时达到高峰(分别为52.82±3.91,38.55±3.44),10U/ml肝素明显降低其表达(29.98±0.65,22.05±2.55);LPS刺激使E-选择素,ICAM-1mRNA水平于6小时达到高峰(26.42±2.11,10.86±0.32),10U/ml肝素明显降低其表达(19.97±1.81,5.76±0.31),差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 (三)肝素对p38 MAPK磷酸化的影响　　 脂多糖能刺激p38 MAPK发生磷酸化,2小时最明显,肝素减少p-p38 MAPK的表达,以10U/ml作用明显,6小时p38 MAPK表达及磷酸化均明显减少。　　 (四)肝素对NF-κB活化的影响　　 脂多糖刺激IκB-α发生降解,其蛋白水平明显下降,肝素抑制IκB-α的降解,2小时最明显;脂多糖刺激2小时NF-κB向核内转移发生活化,肝素逆转了NF-κB的核移位。　　 结论：　　 1.脂多糖导致内皮细胞损伤,产生炎症因子和粘附分子增多　　 2.肝素抑制脂多糖导致内皮细胞损伤的炎症反应,10U/ml肝素作用更强烈　　 3.肝素可能通过抑制p38 MAPK磷酸化及NF-κB的活化发挥对内皮细胞的抗炎作用　　 4.肝素在脓毒症导致急性肺损伤中可能通过内皮细胞发挥抗炎作用