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Egr-1与骨桥蛋白在大鼠血管平滑肌细胞中的相关性及其机制的研究前言动脉粥样硬化性疾病、血管重建术后再狭窄（restenosis,RS）、高血压等血管重塑相关性疾病已经愈来愈严重地威胁着人类的健康。目前认为,血管中膜平滑肌细胞（smooth muscle cell,SMC）向内膜下迁移与增殖是血管重塑的主要病理基础之一。研究表明,某些转录因子（transcription factors,TF）可以调节多个血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）增殖相关基因的表达,从不同层面调控VSMC的迁移与增殖。同时,人们也逐渐注意到细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在血管重塑过程中的重要地位。研究发现,ECM在各种外界刺激的作用下,可以作为细胞外信号,经跨膜信号传递系统到达核内,激活一系列调控VSMC增殖的TF,从而推动VSMC的分裂、迁移及增殖。TF与ECM在血管重塑的过程中密不可分,因此将二者有机地联系在一起,并对其相互作用关系进行深入探讨,将有助于全面了解血管重塑的细胞与分子机制。早期生长反应因子-1（eally growth response factor-1,Egr-1）作为一种锌指结构TF,参与多种基因的调控,与细胞增殖关系密切。大量研究表明,Egr-1在介导VSMC迁移、增殖过程中发挥着重要的作用,成为目前血管重塑机制研究中的焦点。骨桥蛋白（osteopontin,OPN）作为ECM中一种重要的功能性蛋白,被认为是血管损伤重塑过程中重要的始动因素,应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的表型转化、迁移和增殖。尽管Egr-1和OPN在介导VSMC迁移、增殖过程中均起着重要的作用,但二者之间的关系尚不清楚。本课题拟在以往研究的基础上,对培养的大鼠主动脉VSMCs分别稳定转染Egr-1、OPN基因,并检测转染前后OPN与Egr-1的表达变化,从而分析二者的相关性。并应用染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）方法检测Egr-1与OPN启动子的结合情况,同时通过向OPN稳定转染细胞株中加入细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）的磷酸化抑制剂,检测抑制ERK磷酸化后,OPN上调Egr-1的水平变化,从而对Egr-1与OPN相关性的内在机制进行深入探讨,并为抑制VSMC的迁移、增殖,控制血管壁的不适当重塑提供理论及实验基础。材料与方法1、大鼠VSMC的培养大鼠A10主动脉VSMC细胞株购自ATCC细胞库,用含10%胎牛血清（fetalbovine serum,FBS）的DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,用0.25%的胰酶消化、传代。2、质粒的提纯、扩增及稳定转染委托TaKaRa公司对pCMV-Egr-1/NEO、pCMV（-）/NEO质粒及pET-28-rOPN/NEO、pET-28（-）/NEO质粒进行提纯、扩增及鉴定,其中pET-28-rOPN/NEO和pET-28（-）/NEO质粒被连于CMV启动子上,以便在VSMC中表达。待培养的VSMCs生长到80%汇合度时,以100μg/ml～1mg/ml的新霉素（neomycin418,G418）浓度进行最低G418浓度筛选。当培养的VSMCs在6孔板内达到80%汇合度时,应用FuGENE6分别向VSMCs内转染pCMV-Egr-1/NEO、pCMV（-）/NEO质粒及pCMV-ET-28-rOPN/NEO、pCMV-ET-28（-）/NEO质粒。细胞转染24小时（hour,h）后,加入400μg/ml G418的培养液进行培养。2周后,采用有限稀释法将细胞传至96孔板中进行单克隆化培养（于含200μg/ml G418的条件培养液中）,待长满后进行扩大培养,并检测细胞中Egr-1、OPNmRNA的表达。3、应用ERK磷酸化抑制剂阻断ERK信号传导通路当OPN稳定转染的VSMCs生长至80%汇合度时,向细胞培养液中加入10μMERK磷酸化抑制剂PD98059,继续培养24h后,进行Western blot检测。4、反转录多聚酶链反应（reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR）检测Egr-1、OPNmRNA用Trizol Reagent提取VSMCs的总RNA。用RNA PCR Kit Ver.3.0扩增目的片段。PCR产物电泳后,用溴化乙啶（ethidium bromide,EB）染色,BioImaging Systems系统成像,用NIH image软件分析产物条带灰度,以Egr-1、OPN产物条带灰度值与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceralde-3-phosphate dehydrogena,GAPDH）产物条带灰度值的比值分别作为Egr-1、OPNmRNA的相对表达量。5、Western blot检测Egr-1、OPN、ERK、P-ERK蛋白提取细胞总蛋白,上样量为80μg。转印到PVDF膜上后用5%脱脂奶粉封闭,用Egr-1兔抗大鼠多克隆抗体（1:300）、OPN兔抗大鼠多克隆抗体（1:500）、ERK兔抗大鼠多克隆抗体（1:200）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phosphoextracellularsignal-regulated kinase,P-ERK）兔抗大鼠多克隆抗体（1:200）及兔抗大鼠α-tubulin多克隆抗体（1:500）4℃孵育过夜,分别用相应的二抗37℃孵育2h,ECL发光1分钟,胶片中的蛋白条带经BioImaging Systems采集后进行灰度值测定。目的蛋白灰度值与内对照α-tubulin比值为其相对蛋白定量。6、ChIP方法检测Egr-1与OPN启动子的结合分别取2×106个对数生长期的稳定转染Egr-1的VSMCs及正常VSMCs,用甲醛交联,0.125M甘氨酸终止交联。超声剪切染色质脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）成500～1000个碱基对（basepair,bp）片段。分别取50μl全细胞抽提物作为实验和阴性对照样本。用ChIP缓冲液10倍稀释后各取其中10μl合并作为输入对照（input）,在实验样本中加入5g Egr-1兔抗大鼠多克隆抗体（1:300）,将实验样品及阴性对照样本4℃孵育过夜。几次洗涤后,复合物从珠子上洗脱下来。用酚氯仿抽提纯化DNA,最后应用于PCR分析。7、统计学分析采用SPSS11.0统计软件进行数据分析。Egr-1与OPN的相关性用双变量相关分析法（Spearman相关分析）,不同组间的参数比较用One-way ANOVA分析,两两比较采用LSD方法,P＜0.05有统计学意义。实验结果1、RT-PCR结果显示:Egr-1稳定转染组的Egr-1mRNA较正常对照组和空载体组表达明显增强（p＜0.01）;OPN稳定转染组OPNmRNA与正常对照组和空载体组比较,表达也明显增强（p＜0.01）。2、RT-PCR及Western blot方法检测Egr-1和OPN稳定转染VSMCs后OPN和Egr-1的表达水平。结果显示:与正常对照组和空载体组比较,Egr-1转染组的OPNmRNA及蛋白表达均随着Egr-1表达的增强而明显上调（p＜0.01）;同样,OPN稳定转染组的Egr-1mRNA及蛋白表达较正常对照组和空载体组明显升高（p＜0.01）。3、ChIP结果显示:无论正常对照组还是Egr-1稳定转染组的Egr-1抗体免疫沉淀DNA中均可以扩增出含OPN启动子结合位点的基因调控区片段。4、Western blot结果显示:正常对照组与OPN转染组给予PD98059后,与未处理组比较,P-ERK/ERK表达均明显减少（p＜0.01）,同时,Egr-1表达明显下调（p＜0.01）。结论1、成功建立了Egr-1、OPN的稳定转染细胞株。2、Egr-1无论在转录水平还是在翻译水平均可影响OPN的表达,同样,OPN也可以影响Egr-1的表达,二者的表达呈正相关性。3、VSMC中,OPN启动子区域存在着Egr-1的结合位点,Egr-1参与了对OPN基因的转录调控。4、OPN可以通过ERK途径反馈上调Egr-1的表达。5、VSMC中,Egr-1与OPN之间形成一个作用级联放大的正反馈环。