论文部分内容阅读
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种常见的临床致病菌。根据世界卫生组织报道,PA对多种抗生素,特别是碳青霉烯和第三代头孢菌素,具有多重耐药性,其生物被膜的形成是产生耐药性的主要原因之一。生物被膜能够抵抗宿主的免疫反应和抗生素的治疗,当生物被膜形成时,由于被膜的相对不渗透性和微生物易变的生理状态,降低了细菌对抗生素的敏感性,进而导致耐药性的产生。中药是我国特有的文化瑰宝,也是新药来源的一大宝库,从我国传统中药中发现抗菌活性物质,尤其是从清热解毒中药中进行挖掘,是目前新型抗生素发现的重要途径之一。中医药理论认为,清热解毒中药,药性寒凉,能够减轻或消除细菌、病毒等病原微生物感染所引起的热证症状,应用于临床抗感染治疗具有有效性和合理性。本论文针对清热解毒中药,选择近期临床收集的PA进行亚抑菌浓度下的抗生物被膜研究,以期能找到具有抗临床耐药PA生物被膜活性或降低PA毒力因子分泌的物质基础并进行相关机制研究,为临床抗感染治疗提供理论支撑。论文分四部分进行研究。第一部分:研究对象的筛选。首先,本课题对近期收集的28株临床PA菌株进行双重筛选,筛选出耐药和产膜能力最强的菌株做为研究菌株。其次,从最常见的13种清热解毒中药中,通过已筛选出的研究菌株建立生物被膜模型筛选出具有较强清除生物被膜作用的金银花和连翘做为重点研究药物。第二部分:金银花和连翘对PA毒力因子的影响。首先实验获得金银花和连翘对PA的最小抑菌浓度,其次对其生长曲线进行研究,发现在亚抑菌浓度1/2 MIC-1/16 MIC下,金银花、连翘在24 h内均对PA的生长存在一定的影响。其中金银花对PA的影响较为明显,且存在一定的量效关系。根据进一步的实验表明,金银花可以在亚抑菌浓度1/4 MIC下同时抑制PA菌株绿脓菌素和弹性蛋白酶的分泌,而连翘对这两种毒力因子均无抑制作用,故本课题将重点对金银花抗生物被膜的机制及物质基础进行研究。第三部分:金银花抗生物被膜作用与群体感应系统（quorum sensing,QS）的关系。PA生物被膜的形成与很多毒力因子的分泌均与QS系统调控有关。本课题主要选取QS系统中主导调控的LasR/LasI、RhlR/RhlI两对基因,采用荧光定量PCR法观察金银花是否能对该系统中上述基因产生影响。结果发现,金银花在亚抑菌浓度下,可以下调LasR、RhlR和RhlI这三个基因。第四部分:金银花抑制PA生物被膜的物质基础研究。大量文献报道,金银花中发挥抗菌作用的主要物质是酚酸类成分,如绿原酸、原儿茶酸、奎尼酸等。本课题首先在体外对这些酚酸类成分进行生长曲线的测定、生物被膜及毒力因子和相关基因的研究,发现绿原酸在亚抑菌浓度下,对PA的生物被膜及毒力因子和QS系统中的主要基因均有抑制作用,而原儿茶酸、奎尼酸上述作用与绿原酸相比较弱。在体内,绿原酸化学性质不稳定,且很快被代谢,并非最终的抗菌物质基础。基于此原因,本课题对绿原酸体内经过肠粘膜和肝脏代谢后的13种主要代谢物对临床上常见的致病菌株:铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等的抗菌作用进行了研究和溯源。结果显示,对大多数受试菌株,部分主要代谢物抗菌作用与绿原酸比较有所增强,分别提高466倍,以苯甲酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸、二氢咖啡酸和没食子酸最佳,其中二氢咖啡酸、没食子酸对（Methicillin-sensitive staphylococcus aureus,MSSA）和（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的抗菌作用分别提高3366倍,但对PA的抗菌活性较弱;在绿原酸13种代谢产物中,除了奎尼酸（MIC1/64 MIC）和二氢咖啡酸（1/2MIC）对PA生物被膜具有消除作用外,其余代谢物均明显无影响。综上所述,本课题发现清热解毒中药金银花通过下调QS系统中LasR、RhlR和RhlI等关键基因,产生消除生物被膜,抑制毒力因子分泌的作用;其主要的酚酸类成分绿原酸可能是其抗生物被膜的物质基础之一,但由于其易被代谢,故最终产生抗生物被膜作用的物质基础可能是其代谢产物奎尼酸（也是金银花中的有效成分）或二氢咖啡酸。同时,实验也发现,绿原酸的代谢产物二氢咖啡酸在体外对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用,结合前期的LD50预实验结果,二氢咖啡酸对小鼠的毒性非常低,故二氢咖啡酸对金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究有待后期进行深入研究。