研究背景我国是全世界肝癌的高发地区之一,其占我国恶性肿瘤死亡原因的第三位。早期肝癌往往不易发现,一旦发现多数已属中晚期,即使手术切除,大部分患者仍会在术后5年内发生转移和复发。总的来说,肝癌的发生发展与基因组不稳定和突变有密切关系,基因表达失控和蛋白调节紊乱现象的积累最终导致了肝癌的发生与发展。近年来,虽然在肝癌的临床研究方面取得了很多进展,如多蛋白激酶抑制剂—索拉菲尼用于肝癌的治疗。但是肝癌早期诊断难,晚期治疗效果差的现状仍然没有被改变。因此,深入理解肝癌发生发展的分子机制,寻找新的治疗及药物靶点迫在眉睫。人类SUSD2基因位于22q11-q12,编码蛋白含有822个氨基酸,为一类位于细胞质膜的Ⅰ型膜蛋白,其蛋白质结构包括4部分：促细胞生成素B结构域(Somatomedin B domain,SMB); AMOP; von Willebrand factor,type D结构域(vWD); Sushi/SCR/CCP结构域。其中AMOP是一个胞外结构域,有研究表明,该结构域与细胞粘附有密切关联。von Willebrand factor (vWF)属于生长调节因子,该结构存在于多种血浆蛋白中,细胞内主要功能包括转录、DNA修复、膜运输和蛋白酶体作用。含有v WF结构的多蛋白复合体的功能包括细胞粘附、迁移、信号传导等。近年来,SUSD2基因在肿瘤中的作用得到了一些学者的关注,口前的研究表明SUSD2在非小细胞肺癌、乳腺癌、肾透明细胞癌以及结直肠癌中都存在异常表达,然而对于SUSD2基因在肝癌中的表达及生物学功能还未见报道。因此,本课题以肝癌为对象,首先在临床标本中进行SUSD2基因表达水平的检测,再通过脂质体转染技术上调和下调该基因在细胞中的表达水平进行生物学功能研究,以期发现新的肝癌生物指标和治疗靶点。研究方法1、采用GEO数据库中肝细胞癌相关的两个组织标本表达谱基因芯片数据GSE17856、GSE45114,利用生物信息学软件Qlucore Omics Explorer (QOE)分别分析并筛选出在肝细胞癌组织与癌旁正常肝组织中表达有差异的基因,合并两组数据,筛选出共同上下调表达的差异基因。利用DAVID在线分析这些共同表达差异的基因的通路及功能,结合文献发现新的肝癌相关基因。2、采用荧光定量PCR和Western Blot检测8例接受肝癌切除手术的患者标本以及对应癌旁正常肝组织中SUSD2 mRNA和蛋白质表达水平。3、通过免疫组化联合组织芯片的方法,分析SUSD2在180例肝癌组织及16例正常肝组织中的表达水平以及SUSD2蛋白的细胞定位。采用ROC曲线确定SUSD2高表达的最佳取舍点(cut-off值)并初步分析SUSD2表达水平与肝癌患者的临床病理学特征之间的关系。4、利用脂质体转染技术,将pcDNA3.1-SUSD2质粒载体和psi-mH1-SUSD2质粒载体转入HepG2和SMMC7721细胞中,利用Western Blot进行重组细胞SUSD2蛋白表达水平的鉴定。5、采用CCK-8法检测上调和下调SUSD2表达水平后对HepG2和SMMC7721细胞增殖能力的影响。6、流式细胞术检测SUSD2表达水平的变化对细胞凋亡的影响。7、划痕愈合实验检测SUSD2表达水平的改变对HepG2和SMMC7721细胞迁移能力的影响。8、Transwell实验检测SUSD2表达水平的改变对细胞侵袭能力的影响。研究结果1、肝细胞癌相关基因的筛选及生物信息学分析：利用QOE软件筛选出共同差异表达基因353个,其中共同上调基因171个,下调表达基因182个。运用DAVID在线分析软件对这些差异基因进行功能注释和通路分析,发现这些基因的主要功能与细胞凋亡、细胞粘附、氧化还原等有关,还与p53信号通路、Jak-STAT信号通路等相关。对差异基因进行文献挖掘,首次发现SUSD2基因可能与肝细胞癌有关。2、SUSD2基因在8例新鲜临床样本中的表达水平分析：利用q-PCR和Western Blot检测8例接受肝叶切除手术的患者标本以及对应癌旁正常肝组织中SUSD2的表达情况,q-PCR结果显示：8例临床样本中,7例肝癌组织的SUSD2 mRNA表达水平显著低于对应的癌旁正常组织(P<0.05)。Western Blot结果显示8例临床样本中,7例肝癌组织中SUSD2蛋白表达水平显著低于癌旁正常肝组织,与q-PCR结果一致。3、利用免疫组化检测SUSD2在180例肝癌及16例正常肝组织中的表达水平以及细胞定位。结果显示：SUSD2蛋白主要分布在包浆和包膜。根据临床病理资料(性别、年龄、pT、pN、pM、临床分期、组织学分级)绘制出的ROC曲线,结果提示阳性表达的肿瘤细胞在所有肿瘤细胞数中所占比例超过52.5%为高表达。基于此最佳临界值,在大部分肿瘤组织样品中SUSD2呈现低表达(112/180),而在正常肝组织样品中呈现高表达(16/16),两者具有统计学差异(P=0.000)。进一步分析SUSD2表达量与临床病理特征间的关系,结果表明：SUSD2的表达量与pT分期(χ2= 33.175, P= 0.000), pN分期(χ2= 4.785, P= 0.029)、pM分期(χ2=4.620,P=0.032)、病理分级(χ2=5.198,P=0.023)、临床分期(χ2=30.244,P=0.000)有关,而与性别(χ2=0.31,P=0.861)和年龄(χ2=1.093,P=0.296)无显著相关性。4、经Western Blot检测,瞬时转染了重组质粒pcDNA3.1-SUSD2的HepG2细胞中SUSD2表达水平显著高于对照组,转染psi-mH1-SUSD2的SMMC7721细胞中SUSD2的表达水平显著低于对照组。5、CCK-8检测细胞增殖能力,实验结果显示：提高SUSD2的表达水后,能够对HepG2细胞增殖产生显著的抑制作用(P<0.05)；降低SUSD2的表达水平后能够对SMMC7721细胞的增殖产生显著的促进作用(P<0.05)。6、流式细胞术检测SUSD2表达量的改变对细胞凋亡的影响,实验结果表明,上调SUSD2的表达水平后HepG2细胞的凋亡数量与对照组相比显著增加(P<0.05),下调SUSD2的表达水平SMMC7721细胞的凋亡数量较对照组显著减少(P<0.05)。7、划痕愈合实验结果表明,在过表达组,HepG2细胞迁移的相对距离较对照组显著降低(P<0.05),在干扰组,SMMC7721细胞迁移的相对距离较对照组显著增加(P<0.05)。8、Transwell基质胶小室法检测细胞侵袭能力,结果显示：在过表达组,HepG2细胞穿膜数较对照组显著减少(P<0.05),在干扰组,SMMC7721细胞穿膜数较对照组显著增多(P<0.05)。结论通过对两组基因芯片表达谱数据的生物信息学分析及文献挖掘,发现新的肝癌相关基因SUSD2。收集临床标本,分析SUSD2基因在临床标本中的表达量,发现SUSD2(?)表达于肝癌组织而相对高表达于正常肝组织。进一步分析发现SUSD2的表达水平与肝癌的发生发展相关,SUSD2表达量越低,癌组织分化程度越低,临床分期越高。在生物功能方面,分别建立了转染过表达载体和干扰载体的HepG2细胞株和SMMC7721细胞株；证明了上调SUSD2的表达量能显著抑制细胞的增殖能力,抑制细胞的迁移和侵袭能力、促进细胞的凋亡；下调SUSD2的表达量能显著促进细胞的增殖、促进细胞侵袭和迁移能力,抑制细胞的凋亡。综合以上实验,SUSD2参与了肝癌的发生发展,且可能作为抑癌基因发挥作用,为进一步理解肝癌的分子机制提供了新的视角,也为肝癌的诊断及治疗提供了新的研究靶点。