叶酸可通过参与一碳单元代谢直接调控肝脏的糖脂代谢、核酸代谢以及氨基酸代谢等过程,还可作为甲基供体直接介入表观遗传修饰。因此添加叶酸会产生特定的生物学代谢模式,影响父母代种鸡糖脂代谢等相关基因的表达模式及其表观遗传修饰,进而对父母代种鸡的生长发育过程发挥调控效应。这种营养表观遗传学模式在家禽中是否具有可传代性及其传代机制,是本试验的核心。基于对文献的把握及前期工作积累,本试验假设:非编码RNA能够介导叶酸调控肉鸡糖脂代谢以及生长发育相关基因的表观遗传修饰变化的传代过程。本试验通过建立肉种公鸡传代的叶酸调控的表观遗传调控模型,以种公鸡及其子一代的肝脏样品和种公鸡的精子细胞为研究对象,重点选取糖脂代谢相关基因,从检测种公鸡及其后代叶酸调控的肝脏糖脂代谢基因以及相关非编码RNA的表达模式入手,结合种公鸡精子细胞中非编码RNA及转录组测序数据,通过比对分析及后期相关非编码RNA的功能验证,明晰叶酸调控糖脂代谢相关基因表达的分子靶标,构建非编码RNA介导的叶酸调控肉鸡糖脂代谢及生长发育的父系传代表观遗传机制。试验1.种公鸡饲粮添加叶酸对种公鸡和商品代肉鸡生长发育及糖脂代谢的影响本试验将200只1日龄的爱拔益加肉种公鸡随机分为5个处理,每个处理5个重复,每重复8只鸡;分别在五个处理种公鸡饲粮中添加不同水平(0、0.25、1.25、2.50和5.00 mg/kg)的叶酸。35周龄时通过人工授精及孵化分别获取其子一代肉鸡;每个处理的每个重复随机选择8只子一代肉鸡分别饲养至21日龄。记录种公鸡及子一代肉鸡的生长发育情况,进一步比对分析肉种鸡及1日龄和21日龄的子一代肉鸡中叶酸对肉鸡肝脏糖脂代谢及血脂代谢的影响,研究叶酸对肉鸡糖脂代谢的传代调控作用。在本试验中,种公鸡叶酸添加有利于其肝脏发育,减缓法氏囊的退化过程;对于其后代肉鸡而言,种公鸡叶酸添加可以促进其法氏囊的发育。同时,种公鸡饲粮中叶酸添加可以显著促进种公鸡及其子一代肉鸡的肠道发育情况,包括种公鸡的十二指肠绒毛发育以及其后代肉鸡的空肠肠绒毛发育以及盲肠的发育。种公鸡饲粮叶酸添加还可以增加子一代肉鸡的出生重,并降低其0-21天饲养过程中的料重比。本试验进一步检测了种公鸡的精液品质,并未发现显著变化。然而,种公鸡饲粮中额外添加叶酸可以显著提高受精蛋的孵化率,结合子一代肉鸡出生重的提升以及器官发育的促进,我们推测叶酸可以促进子一代肉鸡的胚胎发育过程。基于叶酸对脂代谢的潜在调控效应,我们进一步研究了种公鸡叶酸添加对种公鸡及其后代肉鸡脂代谢的调控及传代调控作用。在本试验中,种公鸡饲粮中添加不同水平的叶酸可以显著降低其血浆中的HDL-C、LDL-C及VLDL-C的含量,同时降低其血浆中脂联素的含量。在1日龄子一代肉鸡中,血浆中的TG、LDL-C、VLDL-C、FFA含量均可以受到种公鸡叶酸添加的传代调控。在21日龄子一代肉鸡中,其血浆中的HDL-C、LDL-C以及脂联素的含量会受到种公鸡叶酸添加的传代调控。对肝脏脂代谢指标而言,种公鸡饲粮中添加不同水平叶酸可以显著增加种公鸡肝脏中的TG、TC、FFA的含量,同时显著降低种公鸡肝脏中HDL-C及肉碱的的含量。对于子一代肉鸡而言,1日龄和21日龄肉鸡的肝脏总胆固醇含量,1日龄肉鸡的肝脏MDH酶活性,以及21日龄肉鸡的FFA含量均会由于种公鸡叶酸的添加而得到显著的提升。在糖代谢方面,种公鸡及1日龄子一代肉鸡肝脏的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性、1日龄及21日龄的丙酮酸激酶活性、种公鸡及其21日龄子一代肉鸡的柠檬酸合酶活性均在种公鸡的叶酸添加下得到了显著的提升,表明其糖异生能力、糖酵解能力和糖的有氧氧化能力的显著提升。本试验结果表明:种公鸡饲粮添加叶酸可以传代调控肉鸡的胚胎发育过程,包括其机体生长及器官发育过程,进而利于肉鸡的出生后生长,增加其饲料转化效率;与此同时,种公鸡饲粮全期添加叶酸会调控并传代性调控种公鸡及其后代肉鸡的糖脂代谢过程。试验2.种公鸡饲粮添加叶酸传代调控肉鸡糖脂代谢过程中关键代谢通路筛选根据已获得的显型差异,为了进一步证实叶酸对肉鸡糖脂代谢的传代调控作用,分别对种公鸡以及相应子一代肝脏进行代谢组分析。在种公鸡肝脏中,叶酸添加可以导致16种与糖脂代谢及核酸代谢相关的代谢物的差异表达,包括6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖等糖异生以及糖酵解过程的重要中间代谢产物,6-磷酸葡萄糖、5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖等磷酸戊糖途径中的重要中间代谢产物,反式不饱和脂肪酸、2-磷酸甘油、3-磷酸甘油和乙醇胺等参与甘油脂代谢、甘油磷脂代谢以及脂肪酸代谢的关键代谢物,以及诸多参与种公鸡的嘌呤及嘧啶代谢的差异代谢物。基于筛选出的差异代谢物,我们进一步地对差异代谢物所涉及的差异代谢通路进行了富集分析,结果显示:磷酸戊糖途径、嘌呤代谢、泛酸及辅酶A的生物合成和糖酵解/糖异生代谢通路在本试验中得到了显著富集,证明叶酸可对糖脂代谢和核酸代谢过程发挥显著的调控作用。在1日龄子一代肉鸡肝脏中,我们鉴定出15种参与肝脏糖脂代谢和核酸代谢过程的代谢物可以受到种公鸡叶酸添加的显著调控。进一步地代谢通路富集分析也表明1日龄子一代肉鸡的糖异生及糖酵解、氨基酸代谢及脂代谢相关的代谢通路会受到种公鸡叶酸添加的传代调控。在21日龄子一代肉鸡肝脏中鉴定出了7种差异代谢物,且这7种差异代谢物均与脂肪酸代谢、甘油磷脂代谢以及糖代谢过程相关;进一步的代谢通路富集分析表明脂代谢过程(脂肪酸代谢及甘油脂代谢过程)、核酸代谢过程和糖代谢过程仍然是显著变化的代谢通路。基于父本和子一代各自筛选到的差异代谢物,以及差异代谢物所富集到的显著通路,我们发现种公鸡饲粮叶酸添加可以调控其本身的糖脂代谢过程以及核酸代谢过程,主要包括糖异生/糖酵解、甘油脂类代谢、脂肪酸代谢及嘌呤代谢等代谢通路的变化;同时可以传代调控子一代肉鸡的糖脂代谢过程,主要包括糖酵解/糖异生以及甘油脂代谢过程等。试验3.叶酸传代调控肉鸡生长发育及糖脂代谢的关键效应基因及信号通路本试验采用转录组学研究种公鸡饲粮添加叶酸,对种公鸡及其子一代肉鸡基因表达的响应性变化,并揭示叶酸对种公鸡及其子一代肉鸡代谢过程的分子调控网络。在种公鸡叶酸添加的调控下,我们在种公鸡肝脏中共筛选到42个差异表达基因,在子一代肉鸡中则筛选到了69个差异表达基因。通过Venn图分析,我们可以发现共有4个基因为共差异表达基因,包括了PEPCK、MYCL、ANGPTL4和THRSP基因。通过对这四个基因的功能进行分析可以得知,其中的三个基因均与肝脏的糖脂代谢相关。对种公鸡及子一代肉鸡差异表达基因进行GO及KEGG分析,从而阐明差异表达基因参与的生物调控功能。综合分析种公鸡及子一代肉鸡的GO分析结果,叶酸添加所导致的差异表达基因主要涉及组织器官的发育以及种公鸡及子一代肉鸡肝脏的糖脂代谢相关的生物学过程。KEGG信号通路功能富集分析结果则表明,在种公鸡及子一代肉鸡中,其差异表达基因均富集到与糖脂代谢相关的信号通路,包括糖酵解/糖异生代谢通路、PPAR信号通路、FOXO信号通路、丙酮酸代谢通路等。进一步筛选种公鸡饲粮叶酸添加所调控的种公鸡精子中的差异表达基因并结合后续的GO富集分析,结果表明精子细胞中的差异表达mRNA同样参与了胚胎发育调节、核酸代谢、氨基酸代谢、糖脂代谢以及免疫功能调控等生物学过程。综合分析各叶酸处理组差异表达基因富集的相关KEGG通路,我们可以发现胚胎发育调控以及糖脂代谢相关的信号通路在各叶酸处理组中均有显著富集,表明叶酸调控下的精子中相关基因的表达变化与肝脏中相关基因的表达变化具有一致性。本试验结果表明:种公鸡饲粮叶酸添加可以通过改变糖异生/糖酵解、甘油脂类代谢、脂肪酸代谢及嘌呤代谢等信号通路中关键基因的表达,进而调控种公鸡的糖代谢、脂代谢以及核酸代谢过程;与此同时,种公鸡饲粮叶酸添加还可以传代调控子一代肉鸡糖酵解/糖异生以及甘油脂代谢相关信号通路中关键基因的表达,发挥叶酸都后代肉鸡糖代谢及脂代谢过程的传代调控作用。试验4.非编码RNA介导叶酸调控肉鸡生长发育及糖脂代谢的父系营养表观遗传机制本试验进一步采用高通量测序技术来研究种公鸡肝脏、精子及子一代肉鸡肝脏中mi RNA及lncRNA在种公鸡饲粮添加叶酸情况下的差异表达情况,从而阐明miRNA及lncRNA这两种非编码RNA在介导叶酸传代调控肉鸡糖脂代谢及生长发育过程所发挥的表观遗传中介作用。就miRNA而言,种公鸡叶酸添加下,种公鸡及肉仔鸡肝脏分别筛选到31个和23个差异表达miRNA,且诸多差异表达mi RNA均可以调控糖脂代谢相关基因的表达。通过对种公鸡及子一代肉鸡肝脏中差异表达miRNA预测的靶基因分别进行KEGG富集分析,我们发现差异表达miRNA可以调控种公鸡及子一代肉鸡肝脏中诸多与糖脂代谢相关的信号通路,包括脂肪酸代谢通路、胆固醇的生物合成通路、丙酸代谢通路、TCA循环通路、丙酮酸代谢通路以及糖酵解/糖异生等信号通路。结合试验三中筛选差异mRNA所富集的信号通路,我们发现PPAR信号通路、糖酵解/糖异生和脂肪酸代谢等与糖脂代谢相关的信号通路同样被富集。因此,综合肝脏转录组及miRNA测序分析的结果,我们认为miRNA在叶酸调控种公鸡及传代调控子一代肉鸡的肝脏糖脂代谢过程中发挥着重要的调控效应。进一步对种公鸡精子中差异表达miRNA进行筛选及分析表明,精子细胞中的差异表达miRNA可以调控PPAR信号通路、糖酵解/糖异生通路、脂肪酸代谢通路、丙酮酸代谢通路、类固醇生物合成、酮体的合成及分解、丙酸代谢、脂肪酸链延长等一系列与糖脂代谢相关的信号通路,且精子细胞中筛选的信号通路与肝脏中差异表达miRNA及mRNA富集的信号通路具有很好的对应性,表明mi RNA是介导父本叶酸传代影响后代基因表达,进而导致获得性差异糖脂代谢的传代调控效应的潜在机制。就lncRNA而言,我们分别构建lncRNA测序文库,在种公鸡的肝脏及子一代肉鸡的肝脏中分别筛选出了64种和21种受到种公鸡叶酸添加下差异表达的lncRNA,表明lncRNA在叶酸调控及传代调控种公鸡及子一代肉鸡肝脏基因表达过程中同样可以发挥着关键的调控效应。结合筛选出的差异表达mRNA来预测差异表达lncRNA的靶基因及其调控功能;结果表明,在种公鸡肝脏中,差异表达lncRNA调控的生物学过程及信号通路主要涉及到糖脂代谢过程,包括甘油脂代谢、泛酸及辅酶A的生物合成、甘油磷脂代谢、糖酵解/糖异生、PPAR信号通路、FoxO信号通路等被广泛的前期研究所证明的可以参与糖脂代谢调控的信号通路。类似地,在子一代肉鸡肝脏中,差异表达lncRNA调控的生物学过程及信号通路同样涉及到糖脂代谢过程,包括得到广泛证实的可以参与糖脂代谢调控的TGF-β信号通路、胰岛素信号通路和PPAR信号通路。综上,种公鸡叶酸添加下,lncRNA在其调控种公鸡及其子一代肉鸡肝脏糖脂代谢过程中均发挥着传代表观遗传调控效应。进一步分析种公鸡叶酸对种公鸡精子细胞中lncRNA的差异表达的调控效应,结果表明不同叶酸添加水平下可以显著改变种公鸡精液中lncRNA的表达丰度,且不同叶酸添加下差异表达lncRNA调控的生物学过程及相关的信号通路同样涉及到糖脂代谢过程。与此同时,大量与器官发育及胚胎发育的信号通路同样得到了富集,表明叶酸对种公鸡及子一代肉鸡肝脏等器官的发育的调控效应同样依赖于lncRNA。综合试验一、二、三的研究内容,本试验结果表明种公鸡精液中的差异表达lncRNA受到种公鸡饲粮中添加不同水平叶酸的调控,且其可以作为叶酸传代调控后代肉鸡生长发育以及糖脂代谢的重要中介。综上,种公鸡饲粮叶酸添加可以通过改变种公鸡肝脏和精液中miRNA及lncRNA的表达情况并传达性改变子一代肉鸡肝脏中miRNA及lncRNA的表达,调控或传代性调控种公鸡及子一代肉鸡肝脏糖酵解/糖异生通路、PPAR通路、FOXO通路、丙酮酸代谢通路相关基因的表达,从而对种公鸡及子一代肉鸡肝脏的糖异生/糖酵解和甘油脂类代谢等代谢通路发挥调控效应,使得种公鸡及子一代肉鸡的肝脏脂肪分解代谢减少,糖异生及糖酵解能力增强。