肝癌是我国常见恶性肿瘤,其发生率和死亡率均居我国癌症前列,虽然近年来肝癌的诊断和治疗水平都有提高,但其发病率仍有上升趋势。对于早期肝癌患者治疗方式主要采取手术,但术后3年肿瘤复发率高达50%。对于中晚期肝癌患者,经动脉化疗栓塞术(Transarterial Chemoembolization,TACE)是常用的治疗方法,传统抗癌药物的耐药性和不良药代动力学成为治疗的主要障碍。由此可见,目前肝癌仍缺乏有效的治疗方法和预防术后复发的干预手段,因此针对肝癌治疗抵抗和预防术后复发成为目前研究热点,寻找有效治疗方法和预防术后复发手段也是亟待解决的临床难题。目前临床肝癌化疗常用小分子药物,但因化疗药物的多器官毒性及耐药性进一步限制了其在临床中的应用。随着纳米技术的发展,人们研发出负载化疗药物的纳米颗粒,其中脂质体因其具有较高的生物相容性、良好的药代动力学特性及具有“减毒增效”的作用等优点,成为药物应用最广泛的纳米载体。脂质体进入体内后,其自身特性决定了它们的最终生物分布。粒径50-100nm的脂质体能依赖肿瘤组织中的EPR效应(Enhanced Permeability and Retention Effect),增强其在肿瘤组织中的渗透和保留能力。粒径较大的颗粒(>150nm),特别是那些附着在调理蛋白上的脂质体,将被单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocytic system,MPS)识别和捕获,导致95%的纳米颗粒被隔离和清除,从而极大地降低了药物递送的效率。肝脏巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞之一,肝窦内的Kupffer细胞是肝脏中的主要巨噬细胞,占人体组织常驻巨噬细胞总数的80-90%,巨噬细胞作在肝癌发生发展中均发挥主要作用。由于其在肝脏中数量多、吞噬能力强,可以降低纳米制剂靶向递送至肝脏的效率,成为肝癌靶向治疗的重要阻碍。同时,大量临床证据表明,肝癌中巨噬细胞密集浸润与肝癌患者不良预后密切相关。实验数据证实,其可通过促进血管生成、诱导肿瘤细胞上皮间质转化和参与肿瘤环境形成等不同机制促进肿瘤恶性转化。在肝癌发生的起始阶段,巨噬细胞也发挥重要作用。最近研究表明,巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)可以促进肝前体细胞(Hepatic Progenitor Cell,HPC)的自我更新,并通过上调干性相关基因的表达诱导HPC向肝癌干细胞恶性转化,促进肿瘤发生。由此可见,炎症微环境中的巨噬细胞在肝癌发生发展中发挥重要作用。因此,如果利用肝脏中巨噬细胞富集药物的特性,同时杀伤/清除肝脏中巨噬细胞,可以有效抑制肝癌发生,提升肝癌治疗的效果。本课题依据巨噬细胞在肝脏中广分布且具有捕获吞噬脂质体的特性,并结合巨噬细胞在肝癌发生发展中的重要作用,拟制备靶向巨噬细胞含化疗药物及诱发巨噬细胞死亡药物的脂质体,检测脂质体的特性,同时在诱导大鼠原发性肝癌的不同时期给药,观察脂质体对肝癌的预防及治疗作用。在肝脏局部注射该脂质体,一方面可以使化疗药物在肝脏中富集,另一方面可以通过诱发巨噬细胞死亡达到缓释化疗药物和抑制肿瘤发生的双重作用。预期研究结果可望形成肝癌治疗和抗术后复发的新策略。第一部分:靶向巨噬细胞含阿霉素和氯膦酸二钠脂质体的制备及功能分析为了通过靶向肝脏巨噬细胞达到化疗药物在肝脏富集和缓释目的,我们采用薄膜水化—挤压法分别制备了不同粒径的阿霉素脂质体(Liposomal Doxorubicin,Doxil)和氯膦酸二钠脂质体(Clodronate Liposomes,CL-LIP)并分析了其特性,进一步采用流式荧光定量、液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)在体内外实验中观察巨噬细胞对Doxil的摄取作用及Doxil在CL-LIP作用下的缓释作用。我们首先制备了粒径约为100n、180nm、350nm的Doxil,且相关表征分析发现100nm和180nm较350nm Doxil具有良好的稳定性。为了筛选上述易被巨噬细胞吞噬的脂质体,采用不同粒径Doxil孵育NR8383巨噬细胞和大鼠腹腔巨噬细胞,细胞中平均荧光强度值随Doxil粒径增大而升高;体内实验也发现在大鼠肝脏中随着Doxil的粒径增大荧光增强。但从Doxil稳定性考虑,我们选择180nm Doxil进行后续实验。为了确定Doxil在大鼠体内给药的安全剂量,我们观察了阿霉素脂质体对大鼠的毒性,初步确定1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg三个剂量进行第二部分和第三部分实验用药剂量。接下来,我们选择2mg/kg Doxil经脾注射到大鼠体内,通过HPLC-MS检测不同器官中阿霉素浓度发现大鼠肝脏中阿霉素浓度远高于其它器官。表明Doxil可在肝脏中富集。我们制备CL-LIP并通过CCK8和流式细胞术验证了其对NR8383巨噬细胞和大鼠腹腔巨噬细胞的杀伤作用,并观察了CL-LIP对大鼠肝脏的毒性并确定其安全和有效剂量(15mg/kg)。为了进一步明确Doxil在CL-LIP作用下的释放效果,将Doxil与CL-LIP联合给药,HPLC-MS检测大鼠血浆中阿霉素浓度:较单独Doxil给药,联合给药组阿霉素可在血浆中能维持较高药物浓度且持续12h。在第一部分我们成功制备了Doxil和CL-LIP,并对脂质体的相关表征进行了检测,初步观察了其对大鼠的毒性作用,并筛选出180nm Doxil及CL-LIP其在大鼠体内实验中的安全和有效剂量。证实了Doxil与CL-LIP联合应用可提升化疗药物的局部有效浓度,延长化疗药物作用时间。该结果的实现,为Doxil和CL-LIP联合应用于肝癌治疗研究奠定了前期实验基础。第二部分:阿霉素和氯膦酸二钠脂质体联合对大鼠原发性肝癌的治疗作用及机制研究为了探究Doxil与CL-LIP联合给药对肝癌的治疗作用,我们构建了DEN诱导14周大鼠肝癌模型,初步筛选出Doxil在抑制大鼠肝癌发展的有效剂量(2mg/kg),再对DEN诱癌14周大鼠(已成瘤阶段)给予随机分组和相应处理:生理盐水(Control组)、CL-LIP(CL-LIP组)、Doxil(Doxil组)、Doxil与CL-LIP(Doxil+CL-LIP组)。18周观察大鼠肝脏中肿瘤大小和数量、肝功能指标。结果发现Doxil联合CL-LIP给药后大鼠肝癌肿瘤体积缩小、数目减少,DEN导致的肝损伤得到改善。HPLC-MS检测结果明确了Doxil能够在肝癌大鼠中富集,进一步证实了第一部分中Doxil在正常大鼠肝脏中富集的结果。以上结果表明,Doxil在肝脏富集及联合CL-LIP给药可抑制肝癌发展。接下来,我们探讨了其作用机制。对上述各处理组大鼠肝脏进行免疫组化染色发现,联合给药可有效清除肝脏中巨噬细胞。巨噬细胞死亡后,释放出的化疗药物可杀伤周围肿瘤细胞,Tunnel染色结果表明联合给药诱导肿瘤细胞凋亡增多。在DEN诱导肝癌过程中M2巨噬细胞表达增多,且肝癌细胞与M2巨噬细胞共培养可促进其增殖。通过对DEN和DEN+CL-LIP大鼠肝脏中TNFα检测,发现TNFα表达下调。以上结果提示:在DEN诱导的大鼠肝癌模型中,Doxil与CL-LIP联合给药可利用巨噬细胞对脂质体的吞噬作用及CL-LIP对巨噬细胞的特异性杀伤作用(第一部分已证实),一方面清除肝脏中M2型巨噬细胞,减少TNFα的分泌,改善肿瘤微环境;另一方面,巨噬细胞死亡后,释放出的化疗药物可杀伤肿瘤细胞,从而提高对大鼠肝癌治疗作用。第三部分:阿霉素和氯膦酸二钠脂质体联合预防肝癌发生及机制探讨为了探究Doxil与CL-LIP联合在肝癌发生中的预防作用,我们构建了DEN诱导8周大鼠肝癌发生模型,首先筛选出Doxil在抑制大鼠肝癌发生的有效剂量(2mg/kg),再在大鼠DEN诱癌8周即肿瘤形成前期给予随机分组和相应处理:生理盐水(Control组)、CL-LIP(CL-LIP组)、Doxil(Doxil组)、Doxil与CL-LIP(Doxil+CL-LIP组)。12周时观察大鼠肝癌发生率及肝功能指标,并采用H&E及免疫组化染色进一步分析肝脏病理结构。实验结果显示:Doxil与CL-LIP联合给药可显著抑制大鼠肝癌发生,改善肝功能相关指标。接下来,我们探讨了其作用机制。对上述各处理组大鼠肝脏免疫组化染色发现,联合给药可有效清除肝脏中巨噬细胞。巨噬细胞通过分泌TNFα促进HPCs中STAT3磷酸化,进而异常分化形成肝癌。因此,我们检测了HPCs增殖指标(胆管反应增殖指数,PI-DR)及联合用药对TNFα/STAT3信号通路的影响。结果发现联合用药组肝脏中PI-DR值降低,HPCs激活和增殖被显著抑制。此外,联合给药组大鼠血清中TNFα浓度显著降低,且p-STAT3表达下调,STAT3通路被抑制。以上结果提示:Doxil与CL-LIP联合给药通过靶向巨噬细胞,经过CL-LIP靶向杀伤巨噬细胞后,缓慢释放出阿霉素;通过有效清除巨噬细胞和抑制HPCs激活和增殖,从而抑制肝癌的发生。其作用机制可能与Doxil联合CL-LIP清除巨噬细胞后减少TNFα的分泌,从而抑制STAT3通路的激活有关。本研究结果有望为肝癌术后抗复发干预提供新策略。