研究背景骨质疏松症（OP）是一种以骨质量和骨密度降低,骨微结构破坏,骨折风险增高为特征的全身性骨病。动物模型和人群研究表明,暴露于低剂量的内分泌干扰物（EDCs）可降低骨密度（BMD）,增加罹患OP的风险。三丁基锡（TBT）是一种常见的EDC,曾被广泛用于木材防腐剂和船舶防污涂料等途径,具有半衰期长、亲脂性强等特征。人类接触TBT主要是通过食用受污染水和食物。我们前期基于双能X线骨密度检测仪（DXA）测量的大鼠BMD研究表明,暴露于50μg·kg-1的TBT会导致大鼠股骨BMD降低,股骨生物力学强度呈下降趋势。虽然DXA是目前常用的BMD测量方法,但其只能提供骨骼的二维平面图。微型计算机断层扫描（μCT）技术却具有更高的分辨率,不但能揭示骨结构的变化,还能通过分析μCT获得的相关数据进一步计算骨抗扭转刚度的极惯性矩（J0）,以反映骨生物力学的性能。应用μCT研究TBT对骨结构和骨生物力学性能的影响、以及它们与骨密度之间的关系还未见报道。有研究表明,纳摩尔浓度TBT即可激活脂肪形成的关键转录因子,过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ,促进脂肪细胞分化。由于脂肪细胞和成骨细胞来源于共同的前体细胞——间充质干细胞（MSCs）,因而脂肪细胞的增生会引起成骨细胞的减少。体内、外研究显示,TBT可重组骨髓腔内MSCs,使其更倾向于发育成脂肪细胞而降低向成骨细胞分化的潜能,可能影响骨健康。但TBT影响骨健康的分子机制还有待于深入探讨。目的基于课题组前期研究结果,首先应用DXA和μCT分别检测TBT暴露对大鼠股骨骨密度和骨结构的影响;再依据μCT测量所得的数据计算股骨的J0,分析TBT暴露对大鼠股骨抗扭转刚度的影响,以揭示TBT暴露引起的骨密度下降是否会增加骨折的风险。通过检测股骨灰分含量,骨骼钙、磷、镁等矿物质含量以及血清钙、磷含量进一步分析TBT暴露诱发骨密度降低的原因;采用定量PCR、免疫组化技术探讨TBT暴露对成骨、成脂的作用以及骨重建的影响及其机制。方法1、实验大鼠的饲养及处理21日龄的雄性SD大鼠适应性喂养三天后,按体重随机分为四组。用玉米油或氯化三丁基锡（TBTCl）灌胃处理大鼠,每三天处理一次,TBTC1暴露浓度分别为0.5、5或50μg·kg-1。第21次暴露处理后,所有动物整夜禁食,于第二天麻醉后腹主动脉处采集血液,室温静置1小时,2500 rpm*10 min分离血清,储存于-80℃冰箱中备用。快速分离大鼠两侧股骨,去除肌肉和结缔组织,测量其长度和重量。将左侧股骨剪去股骨头和髌面,暴露骨髓腔,使用25ml注射器装满磷酸盐缓冲液（PBS,pH=7.4）冲出骨髓,并于200目的细胞筛过滤,破裂红细胞后,离心弃上清,保存于-80°冰箱备用。其余股骨固定于4%多聚甲醛溶液。2、大鼠骨密度检测使用DXA分析大鼠的股骨BMD。在缓冲液中取出大鼠股骨,使用吸水纸将股骨擦干,摆放于测量仪的工作区域。在股骨的干骺端和骨干中部分别选取0.3cm*0.3cm的正方形区域作为研究区域。设置扫描分辨率为3mm*3mm,扫描速度为60mm/s,各个区域重复实验两次,取两次测量的平均值作为研究区域的 BMD。3、大鼠股骨μCT扫描成像取对照组和50μg·kg-1 TBT组大鼠股骨各四根进行固定,使用ScancoμCT100扫描仪进行扫描。对股骨远端干骺端进行扫描得出骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度、连接密度、结构模型指数。对股骨骨干分析,取骨干中部远端1mm厚的部位作为实验区域,分析总横截面积、皮质横截面积、皮质厚度、骨膜周长、皮质内周长、骨髓面积,并计算极惯性矩。4、极惯性矩的测定根据Jepsen等人提出的方法计算大鼠股骨J0,计算公式为:J0=IML+IAP5、定量PCR分析抽提股骨骨髓总RNA后,加入相应的引物和反应体系,使用定量PCR分析骨生成标志物（Runx2、alkaline phosphatase以及osteocalcin）和脂肪形成标志物（PPARγ、Fabp4及Angptl4）相关基因的表达情况。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参,检查各靶基因溶解曲线并分析各目的基因的相对表达情况。研究TBT暴露对骨髓中脂肪形成和骨生成主要调节转录因子表达的影响。6、大鼠股骨组织形态与结构骨内脂肪细胞数的检测取大鼠股骨,在4%多聚甲醛中固定,置于10%的EDTA溶液中脱钙。脱钙完成后制作石蜡切片,进行HE染色,观察并计数骨内脂肪细胞数。7、大鼠血清相关指标检测检测大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶活性、Ⅰ型前胶原羧基端前肽含量、钙离子浓度和无机磷水平。8、大鼠股骨灰分含量测定取大鼠左侧股骨,使用马弗炉检测大鼠股骨灰分含量。9、大鼠股骨矿物质含量测定取大鼠右侧股骨,使用电感耦合等离子体发射光谱仪检测大鼠股骨的钙、磷镁、锡等元素含量。10、免疫组化检测骨保护素（OPG）又叫破骨细胞抑制因子,可抑制破骨细胞活化,促进破骨细胞凋亡,在骨形成和骨吸收过程中起到十分重要的作用。检测其表达可以反应TBT暴露对破骨细胞数的影响。SOX2（Sry related HMG box2）是诱导多能干细胞分化的初始因子之一,检测其表达可以反应TBT暴露对骨髓腔内干细胞数量的影响。结果1、TBT暴露对大鼠体重和股骨的影响监测结果显示TBT暴露没有显著影响大鼠的体重变化、股骨的骨长和骨重。DXA法检测结果显示50μg·kg-1TBT暴露下大鼠股骨骨干骨密度降低（P<0.05）,干骺端无显著性改变。2、TBT暴露对大鼠股骨结构的影响LCT结果显示TBT暴露未显著影响大鼠股骨远端骨骺部位的骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度、连接密度以及结构模型指数等检测指标;但TBT暴露组显著降低了大鼠股骨骨干部位的骨皮质面积、骨总面积和骨膜周长（P<0.05）,而对骨髓腔面积、骨皮质厚度和皮质内周长无显著性影响。3、TBT暴露下大鼠股骨极惯性矩的改变通过μCT测量所得的数据计算大鼠股骨极惯性矩,结果显示50μg·kg-1TBT暴露组与对照组相比极惯性矩显著性降低26.28%（P<0.05）。4、TBT暴露对成骨、成脂相关基因表达的影响QPCR分析结果表明,TBT暴露未显著改变PPARγ、Fabp4、ALP、Runx2和OC的基因表达。0.5μg·kg-1和5μg·kg-1的TBT暴露组中脂肪形成标志物Angpt14与对照组相比有显著性下降（P<0.05）。5、TBT暴露对大鼠骨内脂肪累积的影响大鼠股骨进行HE染色结果显示随染毒剂量的升高,股骨骨髓腔内脂肪细胞数量呈剂量依赖性增加（P<0.05）。6、TBT暴露对骨代谢的影响大鼠血清骨代谢生化指标,结果显示血清钙、磷含量及成骨细胞相关指标（Runx2,alkaline phosphatase,osteocalcin）均未发生显著性改变,但破骨细胞活性随TBT浓度的增高发生呈剂量依赖性降低,与对照组相比分别为:19.96%（P<0.05）;29.30%（P<0.01）;53.00%（P<0.001）。7、TBT暴露对大鼠股骨矿物质的改变大鼠股骨灰分和骨内钙、磷、镁等矿物质含量未受到TBT暴露的显著影响,骨骼中锡离子浓度低于本方法的检测限。8、大鼠股骨免疫组织化学免疫组化染色结果显示与对照组相比较,50μg·kg-1TBT组大鼠股骨中OPG表达轻微增加;三个TBT组SOX2表达与对照组比较均未发现显著性改变。研究结论1.暴露于50μg·kg-1TBT增加了大鼠股骨骨髓腔内脂肪细胞数量,降低了股骨骨干的骨密度、骨皮质面积、骨总面积和骨膜周长,导致股骨抗扭转刚度的下降,增加了罹患骨折的风险。2.TBT暴露改变了骨髓腔微环境,降低了破骨细胞活性,这可能与OPG的蛋白表达的轻微增加有关。