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氢化可的松(Hydrocortisone, HC)作为重要的肾上腺皮质激素药物和高档甾体药物的合成原料,这一特性一直以来都吸引着国内外企业界和学术者的广泛关注。应用于工业生产HC的菌种,国内主要为蓝色犁头霉(Absidia coerulea),国外为新月弯孢霉(Curvularia lunata)。二者在生产HC的过程中,各具特点。蓝色犁头霉对底物RSA(17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯)具有较高的脱乙酰活性和氧化活性,但由于氧化专一性差,副产物量相对较高,产物的分离精制难。HC对RSA的收率仅为45%,对薯蓣皂素的总收率约为19%。新月弯孢霉氧化专一性较好,副产物量较少,但脱乙酰活性相对较弱,以RS(17α,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮)投料,收率可达55%-60%。本文以现行工业生产HC产率和底物投料方式为对照,采用蓝色犁头霉和新月弯孢霉为菌种,通过工艺方法和底物投料方式的改进,寻找有效提高HC收得率和底物投料浓度的工艺途径。本文利用蓝色犁头霉(Absidia coerulea AS 3.65)和新月弯孢霉(Curvularia lunata AS 3.4381) (=ATCC 12017=NRRL 2380)为出发菌株,通过自然选育的筛选方法,获得相对高活性A. coerulea和C. lunata,传代5-7代,4℃保存,备用。通过对两菌摇瓶初、复筛过程的比较考察,二者发酵特性与前描述相符。为更好发挥二者各自的优点,以协同转化为基础,RSA(4%乙醇体系)为投料底物体系,构建两菌分别培养顺序转化、两菌分别培养同时转化和两菌混合培养与转化三种方案,得到较佳方案为顺序转化。通过对菌丝体投加时间、菌体量和投料负荷的考察,确定出最佳的转化条件—两菌二级接种均为5%(v／v),磷酸缓冲液(pH 6.0)包含底物的转化介质中,A. coerulea先行转化20h时,添加C. lunata构成协同转化体系,并且此体系在首轮投料浓度分别为2g/L和1g/L时,能分别反复利用3和6轮。这较A. coerulea和C. lunata单菌转化,有效地抑制了14α-羟化副产物和其他副产物的产生。在摇瓶实验的水平上,HC产率可高达81.6%(HPLC测得数据)。为进一步提高投料浓度,本文采用相关文献报道常用于甾体转化的有机溶剂为介质,以单菌和协同菌丝体为生物催化剂,筛选到对生物稳定性影响较弱的有机溶剂丙三醇。并通过添加表面活性剂吐温80和对底物体系的前处理方式的考察,建立的Tween80/丙三醇／RSA(1.0／3.0／1.0,v／v／w)底物添加体系使得投料浓度高达5 g／L时,双菌转化体系在104 h内,仍能定量转化底物,得到高产率的HC。且在以3g/L为初始投料的摇瓶放大实验中,协同转化体可重复利用2-3轮,生成的目标产物平均收率达52%。此投料方法较国内现行业所使用投料方式下的产物收率45-47%高出7-5%。可见,建立的底物添加体系比较适合RSA制HC现有国内产业体系的工艺改进,可应用性及技术集成度强,对提升我国甾体激素HC的生产技术水平很有参考价值。另外,所建立的新型底物投料体系Tween80/丙三醇／RSA(1.0／4.0／1.0,v／v／w)被用于单菌C.lunata转化时,C.lunata呈现出较强的脱乙酰活性,且HC产率维持在较高水平。以2 g／L进行投料,5L发酵罐连续2轮和5L摇瓶放大的制备实验,平均收率达53.3%。可见,在合适的投料介质体系中,新月弯孢霉对底物RSA仍能表现出较佳的脱乙酰活性。此途径减少了RSA→RS的化学步骤,节能降耗且环保的特性赋予了其较强的工业应用价值潜力。