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研究背景糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种常见的内分泌代谢性疾病。其基本病理特点为胰岛素分泌绝对或相对不足,或外周组织对胰岛素不敏感,以糖代谢紊乱为主,包括脂肪、蛋白质代谢紊乱的一种全身性疾病。糖尿病的患病率在全球逐年增长。据世界卫生组织WHO估计,至2030年,全球糖尿病患病人数将达3亿。据估计,中国现有成人糖尿病患者9240万,已成为世界糖尿病人数最多的国家。在糖尿病患者中90%以上是Ⅱ型糖尿病,严重影响人们的健康。糖尿病发病机理较为复杂,而胰岛素抵抗在Ⅱ型糖尿病的发生过程中扮演重要角色,但胰岛素抵抗的机制尚不明确。胰岛素是一种蛋白质类激素,由体内胰岛β细胞分泌,体内唯一降血糖激素。胰岛素信号通路涉及多个环节,其中钙离子浓度的变化对胰岛素的分泌有重要影响。有文献报道,在胰岛素信号通路中存在着micro RNA(mi RNA,mi R)-126的作用靶点,且本实验室前期工作证实胰岛素受体底物1(IRS-1)也是其作用靶点。但是mi R-126是否影响胰岛β细胞合成和释放胰岛素尚不明确。本课题利用胰岛瘤B细胞(INS-1)模型,研究mi R-126对INS-1细胞电压敏感钙通道电流、钙离子浓度及胰岛素分泌量的影响。实验方法1.铺种INS-1细胞,24h后转染40n M的不同mi RNA,转染时间为48h,人工合成胰岛素100n M刺激细胞12h。荧光定量PCR检测INS-1细胞中mi R-126基因的表达水平。2.激光共聚焦技术检测INS-1细胞内钙离子浓度变化,分组:①阴性对照组(NC)组,转染nonsense strand;②mi R-126过表达(mi R-126m)组,转染mi R-126 mimic;③mi R-126低表达(mi R-126i)组,转染mi R-126 inhibitor;④阳性对照(mi R-375m)组,转染mi R-375 mimic。3.穿孔膜片钳技术检测INS-1细胞膜上电压敏感钙通道电流,分组:阴性对照(NC)组和mi R-126m组。4.Elisa实验和流式细胞仪,分别检测INS-1细胞胰岛素分泌量及线粒体膜电位变化,分组:阴性对照(NC)组,mi R-126m组,mi R-126i组,阳性对照(mi R-375m)组。实验结果1.荧光定量PCR结果显示:与NC组基因mi R-126(107.26±37.88,n=4)的表达量相比,mi R-126m组(398.77±53.72,n=4)的基因表达量显著升高(P<0.01);而mi R-126i组(20.26±7.827,n=4)的基因表达量较NC组的明显下降(P<0.05)。2.激光共聚焦技术检测INS-1细胞内钙离子浓度,结果显示:基础葡萄糖(5.6m M葡萄糖)刺激细胞,mi R-126m组细胞内钙离子浓度较NC组明显升高(P<0.05),mi R-126i组细胞内钙离子浓度较NC组显著降低(P<0.05);高浓度葡萄糖(16.8m M葡萄糖)刺激细胞,mi R-126m组细胞内钙离子浓度和NC组无显著差异(P>0.05);mi R-126i组细胞内钙离子浓度较NC组显著降低(P<0.05)。穿孔膜片钳技术检测细胞膜电压敏感钙通道电流,结果显示:与NC组相比,mi R-126m组细胞钙离子内流增加(P<0.05)。3.Elisa实验检测胰岛素分泌量,结果显示:基础胰岛素分泌量mi R-126m组较NC组分泌量增加(P<0.05);mi R-126i组胰岛素分泌量较NC组显著降低(P<0.05);高浓度葡萄糖刺激细胞,其胰岛素分泌量:mi R-126m组胰岛素分泌量和NC组无显著差异(P>0.05);mi R-126i组胰岛素分泌量较NC组显著降低(P<0.05)。流式细胞仪检测线粒体膜电位,结果显示:与NC组相比,mi R-126m组和mi R-375m组细胞凋亡增加(P<0.05),mi R-126i组细胞凋亡降低(P<0.05)。实验结论1.过表达mi R-126可以增加INS-1细胞内钙离子浓度,并且使钙离子内流增加;2.过表达mi R-126增加INS-1细胞基础胰岛素分泌量,但能诱导细胞凋亡。