背景及目的： 本研究用Akt激酶活性分析法筛选出Excisanin A能在体外抑制Akt激酶的活性，并进一步深入探讨了Excisanin A通过抑制Akt活性及阻断其下游信号转导途径在体内、外发挥抗肿瘤作用，为Excisanin A的进一步优化及研发提供理论和实验依据。 方法： 用分子克隆技术及脂质体转染法建立稳定转染或瞬时转染的细胞株；用免疫荧光技术或Western blot法观察细胞经低剂量放射线照射后γ—H2AX聚焦点的形成或γ—H2AX蛋白的表达情况，并计数DNA双链受损的阳性细胞；用Western blot法检测细胞中Mrell，phospho—Akt，Akt，phospho—GSK3β和β—catenin蛋白的表达；用RT—PCR法检测细胞中Mrell在mRNA水平的表达；用染色质免疫沉淀(ChIP)法检测β—catenin/LEF与Mrell启动子序列的特异性结合作用；用荧光素酶报告基因检测Akt及β—catenin是否可以诱导Mrell启动子的活性； 结果： 1、PKB/Akt影响肿瘤细胞修复放射线所致的DSBs损伤 1.1抑制PKB/Akt能降低肿瘤细胞对DSBs的修复能力 用4Gy的剂量照射CNE2/vector和CNE2/shRNA Akt1这两组细胞使其产生DSBs，然后在不同的时间进行γ—H2AX聚焦点分析。免疫荧光结果发现照射后30min，这两组细胞均呈现显著的DNA双链断裂损伤，且统计学分析这两组细胞DNA受损的阳性细胞无区别。 1.2增强PKB/Akt的活性能提高肿瘤细胞对DSBs的修复能力 用2Gy的剂量照射HeLa/vector和HeLa/myr—Akt1这两组细胞使其产生DSBs，然后在不同的时间进行γ—H2AX聚焦点分析。免疫荧光结果发现照射后30min，这两组细胞均呈现显著的DNA双链断裂损伤，且统计学分析这两组细胞DNA受损的阳性细胞无区别。 2、PKB/Akt通过GSK3β/β—catenin/ LEF-1途径调控Mre11的表达 2.1 PKB/Akt调控肿瘤细胞中Mre11的表达 当用特异性靶向Akt1的siRNA或LY294002抑制CNE2细胞或MDA—MB—43细胞中Akt的表达或激活后，Mre11的表达随之下调；而当HeLa细胞转染了持续激活的Akt1质粒使Akt的活性增强后，Mre11的表达随之上调；同时我们构建了包含Mre11启动子核心区域的荧光素酶报告基因pGL3-Mre11质粒并进行了活性检测。 2.2 PKB/Akt通过作用于GSK—3β来参与调控β—catenin途径 GSK—3β是Akt下游一个重要的靶分子。在CNE2细胞中，当Akt的磷酸化水平被LY294002抑制后，GSK—3β的磷酸化水平下调，β—catenin的表达也下降；在HeLa细胞中，外源转入持续激活型myr—Akt1质粒增高细胞中Akt的磷酸化水平后，GSK—3β的磷酸化水平增加，β—catenin的表达随之增强。 2.3β—catenin通过转录因子LEF-1调控Mre11的表达 接下来我们又深入探讨了β—catenin与Mre11之间的关系。当用特异性靶向β—catenin的siRNA抑制CNE2细胞及HeLa/myr—Akt1细胞中β—catenin的表达后，Mre11的表达随之下调；而当HeLa细胞转染了β—catenin的质粒使β—catenin过表达后，Mre11的表达随之上调。ChIP实验结果显示β—catenin/LEF-1能在细胞内与Mre11启动子区域的特异序列结合。荧光素酶报告基因结果显示过表达β—catenin能使pGL3-Mre11的荧光素酶活性增高达50％，而过表达β—catenin却不能使LEF-1位点发生突变的pGL3-mtMre11报告质粒的活性增高，这种差别具有显著的统计学意义。与对照组的空白质粒相比，共转染β—catenin表达质粒和野生型pGL3-Lef荧光素酶报告质粒可以使荧光检测活性增高达50％；若共转染β—catenin表达质粒和突变型pGL3-mtLef荧光素酶报告质粒，可使增高的活性下降近10倍。这些结果说明β—catenin可以通过转录因子LEF-1特异性地诱导Mre11启动子的活性，从而上调Mre11的表达，也即证实了Mre11是β—catenin/ LEF-1的转录靶分子。 3、抑制Mre11的表达影响肿瘤细胞修复放射线引起的DSBs损伤 在实验中，我们用2Gy放射线照射Mre11受干扰后的细胞及对照组细胞使其产生DSBs，然后在不同的时间进行γ—H2AX聚焦点分析。免疫荧光结果发现照射后30min，这两组细胞均呈现显著的DNA双链断裂损伤，且统计学分析这两组细胞DNA受损的阳性细胞无区别。到照射后24小时，这两组细胞的DNA损伤得到了不同程度的修复，但Mre11表达受抑制的细胞中γ—H2AX聚焦点明显较对照组细胞多且大。在另外一组实验中我们也得到了类似的结果。当HeLa细胞中的Mre11被有效地抑制后，再接受低剂量照射，48小时后收蛋白，Western blot结果显示γ—H2AX的表达明显高于对照组细胞。以上结果说明抑制Mre11的表达显著损害了肿瘤细胞修复放射线所致的DSBs损伤的能力。 4、Excisanin A对Akt激酶活性的影响 用Akt激酶活性分析法筛选靶向Akt的小分子抑制剂，Western blot结果发现ExcisaninA能明显GSK—3的磷酸化水平，而且随着药物浓度的增高，抑制越明显；在20μM浓度时，ExcisaninA对phospho—GSK—3α/β的抑制率达到84％，而阳性对照药triciribine为67％。这说明ExcisaninA在体外能抑制Akt激酶的活性。 5、Excisanin A诱导Hep3B细胞和MDA—MB—453细胞发生凋亡，并在细胞内抑制Akt的活性及阻断其下游信号转导途径 为探讨Excisanin A的体外抗瘤作用及作用机制，我们选择了Akt活性高表达的人肝癌Hep3B细胞及乳腺癌细胞MDA—MB—453细胞为细胞模型。MTT结果显示Excisanin A能显著抑制Hep3B细胞及MDA—MB—453细胞的增殖，并呈剂量效应关系，其IC50(72 h)值分别为6.5μM(Hep3B细胞)和10.3μM(MDA—MB—453细胞)。而且Excisanin A能增强5-FU对Hep3B细胞或阿霉素对MDA—MB—453细胞的敏感性，其CIs值<1。当用Excisanin A处理Hep3B和MDA—MB—453细胞后，AnnexinV阳性的细胞比例显著增加，且细胞核出现典型的凋亡改变。当用ExcisaninA处理Hep3B细胞和MDA—MB—453细胞后，Western blot结果显示胞内的Akt、FKHR、GSK—3β、mTOR的磷酸化水平在很短的时间内就被明显抑制，并呈浓度依赖性和时间依赖性。为进一步证实ExcisaninA在细胞内能抑制Akt的活性，我们建立了稳定转染激活型myr—Akt1质粒的细胞株Hep3B/myr—Akt1。MTT结果显示与对照组相比，ExcisaninA能明显减少Hep3 B/myr—Akt1组中存活的细胞。以上实验结果说明Excisanin A在Hep3B细胞和MDA—MB—453细胞中通过抑制Akt的活性并使其底物蛋白FKHR、GSK—3β、mTOR去磷酸化，从而阻断其下游信号转导途径，并启动细胞凋亡的进程。 6、ExcisaninA在体内抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生长并阻断Akt/FKHR途径 为探讨Excisanin A的体内抗瘤药效及作用机制，我们建立了Hep3B裸鼠移植瘤模型。结果显示，Excisanin A在20mg/kg/d剂量下能显著抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生长，其抑瘤率达到46.4％。将瘤组织制成的冰冻切片进行TUNEL染色，在荧光显微镜下可观察到20mg/kg/d Excisanin A处理组可见大量TUNEL染色呈阳性的细胞。而且Western blot及免疫荧光的结果也显示20mg/kg/d Excisanin A处理组能抑制Hep3B裸鼠移植瘤中Akt和FKHR的磷酸化水平。这些结果说明Excisanin A在在20 mg/kg/d剂量时能在体内阻断Akt/FKHR信号传导通路，使Akt和FKHR的磷酸化水平降低，从而诱导细胞发生凋亡。 结论： 1、抑制Akt可使肿瘤细胞修复放射线所致的DSBs损伤的能力减弱；而增强Akt的活性，可使肿瘤细胞对放射线所致的DSBs损伤的修复能力增强。 2、抑制Mre11的表达显著损害了肿瘤细胞修复放射线所致的DSBs损伤的能力。 3、在肿瘤细胞中，激活的Akt能通过GSK3β/β—catenin/ LEF-1途径上调Mre11的表达，从而增强肿瘤细胞修复放射线所致的DSBs损伤的能力。 4、Excisanin A能在体外抑制Akt激酶的活性。 5、Excisanin A能通过抑制细胞内Akt的活性并阻断其下游信号转导途径诱导Hep3B细胞和MDA—MB—453细胞发生凋亡。 6、Excisanin A能通过阻断Akt/FKHR信号转导途径抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生长。