异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后动态检测供受者细胞嵌合状态，可用于监测供者细胞植入，判断移植物被排斥或疾病复发，从而指导免疫治疗。DNA序列中的短串联重复序列(short tandem repeats，STR)由于其高度的多态性，使PCR扩增STR成为嵌合状态检测中最灵敏的方法。但是，目前STR-PCR的定性检测方法在供受者细胞混合嵌合时不能判断两者的比例。而在供者细胞植入或移植物被排斥时，供受者细胞有一个此涨彼消的过程，需要准确地定量测定供受者细胞的嵌合比例，从而正确及时的评估供者细胞的植入状态，预测疾病复发，为免疫治疗方案的调整提供理论依据。目前国内外常采用全血和全骨髓样本进行嵌合状态的检测，由于外周血和骨髓中有多种细胞成分，其STR-PCR的检测结果反映的是多种细胞混合的结果。而移植后各种细胞的植入不是完全同步的，同样在移植物排斥和疾病复发时，各种细胞的消退也不同步，而且不同的细胞在移植中发挥不同的作用，因此有必要将不同的细胞分选出来，分别进行嵌合状态的检测。本研究拟建立STR-PCR的定量检测方法，结合流式细胞仪的高效细胞分选功能，动态检测移植后各血细胞的嵌合状态，分析其与移植物被排斥、疾病复发和移植物抗宿主病(graft versus host diseases，GVHD)的关系，寻找出异基因造血干细胞稳定植入的标志和移植物被排斥或疾病复发的分子学先兆，从而指导免疫干预治疗，提高移植成功率。第一部分多重PCR扩增短串联重复序列定量方法的建立【目的】在STR-PCR定性检测的基础上建立定量检测方法。【方法】将移植前供受者外周血根据白细胞计数按不同比例混合，制成人工模拟混合嵌合(mixed chimerism，MC)样本，使供者与受者血细胞比例分别为95：5，90：10，80：20，70：30，60：40和50：50。分别提取基因组DNA后，采用试剂盒AmpFlSTRProfiler Plus PCR Amplification Kit进行多重PCR扩增荧光标记的STR，同步扩增9个STR位点和性别位点Amelogenin。根据每对供受者同一STR位点等位基因的相同或不同，分析出两者的信息位点。优化反应条件，按照定量检测条件下电泳图谱STR峰下面积与相应的PCR产物量成正比的关系，对人工模拟混合嵌合样本PCR扩增后信息位点的峰下面积进行计算，得到供受者细胞嵌合比例。【结果】在20μl PCR反应体系中，加入12μl反应液(8.4μl PCR反应混合物，0.5μl Taq DNA多聚酶，4.4μl引物混合物)，8μl模板DNA(共2.5ng)，95℃预变性11min，然后94℃变性1min：58℃退火1min；72℃延伸1min，共扩增28个循环，最后60℃孵育45min，可以对模板DNA中供受者比例进行定量检测。检测的灵敏度为5％，即可以检测到混合样本中含量最低为5％的细胞成分。影响定量检测的关键是PCR反应中模板DNA的含量。DNA含量过高或过低会在PCR扩增后出现影子带、分裂峰或者等位基因的不均等扩增，这些情况都会影响检测结果的准确性。【结论】通过对定性检测试剂盒条件的优化，成功建立了STR-PCR的定量检测方法，可以更准确地分析嵌合状态的改变，优于目前常规使用的STR-PCR定性检测。第二部分异基因外周血造血干细胞移植后血细胞嵌合状态的临床应用研究【目的】1．观察异基因外周血造血干细胞移植(allogeneic peripheral blood stem cell transplantation，allo-PBSCT)后供者各血细胞的植入顺序；2．观察移植物被排斥或疾病复发时供者各血细胞消退的顺序；3．寻找异基因造血干细胞稳定植入的标志和移植物被排斥或疾病复发的分子学先兆；4．分析GVHD与血细胞嵌合状态的关系；5．分析血型转变与血细胞嵌合状态的关系。【方法】我院28例allo-PBSCT患者，中位年龄38岁(15～54岁)。急性髓细胞性白血病7例，急性淋巴细胞性白血病2例，慢性粒细胞性白血病13例，多发性骨髓瘤(MM)4例，骨髓增生异常综合征(MDS-RCMD)和难治复发卵巢癌各1例。疾病处于进展状态的高危患者13例，稳定状态的标危患者15例。其中HLA完全相合同胞供者移植22例，HLA完全相合无关供者移植5例，半相合亲缘移植1例。清髓性移植12例，非清髓移植16例。供受者ABO血型不合15例。采集供受者移植前、受者移植后+7天、+14天、+21天、+28天、+2月、+3月、+4月、+5月、+6月、+9月、+12月外周血。流式细胞仪分选出外周血粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，分选细胞的纯度达到96％以上。分别对这4种细胞进行STR—PCR定量检测，并检测血常规、骨髓涂片、骨髓染色体和血型，对供受者性别不同患者同步进行XY双色探针荧光原位杂交(florescence in situ hybridization，FISH)，同时观察疾病相关的临床表现、GVHD等。【结果】移植后+7天，88.5％的患者CD3-／CD16+56+NK细胞嵌合比例最高，提示NK细胞最早开始植入。清髓性移植中T淋巴细胞与粒细胞较早开始植入，B淋巴细胞最晚开始植入；非清髓移植中T淋巴细胞相对较早开始植入，B淋巴细胞和粒细胞最晚。无论清髓性移植或非清髓移植，粒细胞、NK细胞和B淋巴细胞在移植后中位时间+14天迅速达到供者完全嵌合(complere chimerism，CC)，而T淋巴细胞都是最晚达到CC，其中位时间分别为移植后的+21天和+28天。28例患者中有7例先后出现移植物被排斥的分子生物学征象或疾病复发，均为髓系肿瘤患者。在出现分子学排斥或疾病复发时，这7例患者都出现了血细胞嵌合比例的下降，其中3例仅T淋巴细胞由CC转变为MC，其它血细胞仍保持CC；2例在复发前后T淋巴细胞嵌合比例始终最低；另外2例血液学复发的患者各血细胞均出现嵌合比例的下降。停用免疫抑制剂和供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion，DLI)后5例患者T淋巴细胞表现为逐渐减少的MC，其中治疗有效的3例转变为CC。提示在移植物被排斥或疾病复发时供者T淋巴细胞最早消退。供者细胞稳定植入并一直保持CC的19例患者中，有8例发生急性GVHD，其中7例在各血细胞均达到CC后发生。而发生分子学排斥、遗传学或血液学复发的7例患者，在被排斥或复发前都没有发生GVHD。CC组的急性GVHD发生率高于复发组的患者，两者有显著性差异(x~2=4.25，P＜0.05)。ABO血型相合与不合组同一时间各血细胞的嵌合比例经比较，无显著性差异(P＞0.5)；两组达到ANC＞0.5×10~9／L和PLT＞50×10~9／L的天数也无显著性差异(P＞0.5)。血型完全转变的时间与粒细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞达到CC的天数呈正相关，相关系数r与P值分别为0.841(P＜0.01)，0.834(P＜0.01)和0.586(P＜0.05)。除了2例发生急性溶血外，其余ABO血型不合患者血型的完全转变都是在各血细胞达到CC以后。PB、BM达到CC的时间与T淋巴细胞有显著性差异(P＜0.01)，后者更晚。在移植物将要被排斥和疾病复发时，T淋巴细胞嵌合比例的变化较PB、BM更早。【结论】1．allo-PBSCT后供者各血细胞植入不同步，主要与预处理强度相关，NK细胞最早开始植入，T淋巴细胞最晚达到完全植入。2．在髓系肿瘤中，发生移植物被排斥和疾病复发时，供者T淋巴细胞最早消退。免疫干预治疗有效的患者T淋巴细胞可以由MC再回到CC。3．GVHD一般在血细胞均达到CC后发生。4．供受者ABO血型不合不影响粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的植入，也不影响粒细胞和血小板数量的恢复。血型完全转变一般都在各血细胞达到CC后。5．T淋巴细胞达到CC可以作为供者细胞稳定植入的标志，髓系肿瘤中其嵌合比例的下降是移植物被排斥或疾病复发的早期征兆，T淋巴细胞嵌合比例的变化可以评判免疫干预治疗的效果。对T淋巴细胞嵌合状态的检测优于目前常规进行的对全血或全骨髓细胞的嵌合状态检测。6．移植后，应当对移植患者密切监测血细胞嵌合状态，根据嵌合状态的转变实施个体化的免疫治疗措施。对于T淋巴细胞早期(1个月内)达到CC的患者，主要是监测GVHD的发生，因此在移植后3个月内，免疫抑制剂的剂量要用足，并适当延长使用时间；而对于供者T淋巴细胞在1个月内未达到CC的患者，主要是监测移植物被排斥和疾病复发，因此在1个月后就开始将免疫抑制剂减量，以促进供者细胞的植入，避免疾病的复发。