γ-氨基丁酸(GABA)和脑啡肽(ENK)能神经元是脊髓背角重要的中间神经元,这些神经元与初级传入纤维、背角浅层的投射神经元、来自上位脑结构的下行投射纤维以及其他类型的中间神经元之间形成复杂的局部环路,在感觉信息传递和调节过程中发挥着重要的作用。由于成熟中间神经元的结构及功能形成于发育时期,它们的正常发育是上述局部环路正确形成的保证,因此很有必要从发育阶段对其开展研究。但目前有关脊髓背角GABA能和ENK能中间神经元的神经化学特点、产生模式、迁移特点及调控机制等尚存许多空白。本研究利用特异性显示GABA能神经元的谷氨酸脱羧酶(GAD)67-绿色荧光蛋白(GFP)基因敲入小鼠和特异性显示ENK能神经元的前原脑啡肽(PPE)-GFP转基因小鼠,综合运用神经形态学、分子神经生物学等手段,开展了以下三部分研究内容:1.脊髓背角GABA能和ENK能神经元的神经化学特点运用荧光原位杂交与免疫荧光双标、单细胞RT-PCR及实时定量PCR等技术,对GAD67-GFP基因敲入小鼠和PPE-GFP转基因小鼠的特异性进行了验证,并系统观察了脊髓背角GABA能和ENK能神经元的神经化学特点、相互的共存关系及5-HT3A受体的表达。结果如下:(1)免疫荧光双标结果显示GAD67-GFP基因敲入小鼠脊髓GFP阳性细胞均表达神经元标志物神经元核蛋白(NeuN),背角浅层GFP细胞分别占I、Ⅱ和Ⅲ层NeuN阳性胞核的31.51%、33.34%和44.70%。将近98%的GFP细胞表达GAD67和GABA。原位杂交组织化学与免疫组织化学双标结果显示所有GFP阳性细胞与GAD67 mRNA共存。PPE-GFP转基因小鼠不同脑区GFP与PPE mRNA的表达模式一致。脊髓GFP阳性细胞均与NeuN、PPE mRNA共存。脊髓背角GFP阳性细胞分别占I、Ⅱ和Ⅲ层NeuN阳性神经元的16.95%、40.68%和12.45%。上述结果提示这两种小鼠中GFP的表达可特异显示脊髓GABA能和ENK能神经元。(2)脊髓背角58.38%、19.63%和2.81%的GABA能神经元分别与钙视网膜蛋白(CR)、小白蛋白(PV)和维生素D依赖性钙结合蛋白(CB)共存;脊髓背角ENK能神经元与CR、PV和CB的共存率为61.15%、5.05%和24.74%;12.44%的ENK能神经元与一氧化氮合酶(NOS)共存;脊髓背角ENK能神经元与囊泡膜谷氨酸转运体1(VGLUT1)和VGLUT2的共存比例为20.61%和21.21%;脊髓背角GABA能神经元与PPE mRNA的共存细胞占GABA能神经元的44.41%,占PPE mRNA的53.93%;单细胞PCR结果表明脊髓背角28.07%的GABA能神经元和22.58%的ENK能神经元表达5-HT3A受体。上述结果为更好的理解GABA能和ENK能神经元在脊髓的功能提供了形态学依据。2.脊髓GABA能神经元的发育模式及调控机制运用GAD67-GFP基因敲入小鼠和Ebf2基因敲除小鼠,结合免疫荧光双标、BrdU标记、脊髓片培养、Time-lapse荧光显微镜动态观察及单细胞RT-PCR等技术,观察了脊髓GABA能神经元的时空分布、起源、迁移模式和调控机制。结果如下:(1) GABA能神经元最早出现在胚胎11.5天(E11.5)脊髓的腹侧部,至胚胎晚期和生后阶段,主要分布在脊髓背角,于E17达到高峰。至P14,GABA能神经元的分布达到与成年脊髓相似的模式。上述结果提示脊髓GABA能神经元的分布具有明显的时间和空间分布特点,呈由腹侧向背侧的分化趋势。(2)脊髓GABA能神经元的产生主要集中在E10.5-E14.5。E11.5和E13.5是两个产生高峰,E10.5产生的GABA能神经元较少,且主要位于脊髓前角。E11.5和E13.5产生的GABA神经元主要分布在脊髓背角浅层和中央管周围。脊髓背角深层的GABA能神经元多产生于E12.5。胚胎晚期仅产生较少的GABA能神经元。(3)在体和离体结果均表明胚胎晚期脊髓套层部分GABA能神经元表达细胞周期标记物Ki-67、5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)和磷酸化的组蛋白H-3(P-H3),提示这些GABA能神经元具有增殖活性。推测在套层内这些具有增殖活性的GABA能神经元是胚胎晚期脊髓GABA能神经元的一个新的来源。(4)脊髓GABA能神经元产生后以放射状迁移的方式到达脊髓套层,然后向背腹方向移动到达其终止部位。E10.5产生的GABA能神经元主要迁移至脊髓前角,而E11.5产生的GABA能神经元则主要迁移至脊髓背角。不同阶段产生的神经元具有特定的迁移模式。(5) Ebf2基因敲除小鼠脊髓背角Pax2的表达下调, Lmx1b、Drg11和Tlx3的表达未发生改变。上述结果提示Ebf2参与了脊髓GABA能神经元的发育调控。3.脊髓ENK能神经元的发育模式运用PPE-GFP转基因小鼠,结合免疫荧光双标技术,观察了脊髓ENK能神经元的时空分布、发育阶段ENK能神经元的神经化学特点及其表达的调控分子。结果如下:(1) ENK能神经元最早出现在E11.5颈段脊髓腹内侧部,腰段脊髓ENK能神经元在E12.5出现。在E13.5,ENK能神经元主要分布在中间带。E14.5时脊髓背侧开始出现ENK能神经元,之后细胞数量逐渐增多,于胚胎晚期和生后阶段,ENK能神经元主要分布在脊髓背角,P21达到与成年类似的分布模式。上述结果提示脊髓ENK能神经元的分布具有明显的时间和空间分布特点,呈腹侧向背侧、吻侧向尾侧的发育趋势。(2)发育阶段脊髓背角ENK能神经元与GABA能神经元的共存比率较恒定,E16时共存细胞占ENK能神经元的43.35%,P3时双标细胞占ENK能神经元的45.02%。不同发育阶段ENK能神经元与CB、PV及CR的共存率不同,提示在ENK能神经元的发育成熟的不同时程中发挥不同的功能。(3) E15.5时ENK能神经元与Pax2的共存细胞占ENK能神经元的65.17%;至P3,GFP/Pax2双标神经元占ENK能神经元的57.74%,且主要分布在背角浅层。在脊髓背角Ⅰ层观察到ENK能神经元与Lmx1b的共存细胞,在E15和E18,共存细胞分别占脊髓背角ENK能神经元的3.48%和4.50%。上述结果为深入探讨脊髓ENK能神经元的发育调控分子机制提供了形态依据。通过上述研究得到了以下结论:(1)较系统地观察了脊髓背角GABA能和ENK能神经元所包含的神经活性物质和5-HT受体亚型,为阐明这两类神经元的神经化学特点提供了实验依据;(2)揭示了脊髓GABA能和ENK能神经元的时间和空间分布特点及GABA能神经元的迁移模式;(3)明确了脊髓GABA能神经元的产生时程规律;首次发现了胚胎发育晚期脊髓套层内存在GABA能神经元祖细胞,提出了脊髓GABA能神经元的新起源;(4)证实Ebf2基因参与脊髓GABA能神经元的发育调节。GABA能和ENK能神经元作为脊髓背角局部环路重要的组成部分,对感觉传递的调控发挥重要作用。因此探讨脊髓背角GABA能和ENK能中间神经元的神经化学特点、神经元的产生、分化特点、迁移方式及调控基因等,不仅有助于理解正常生理状态下脊髓背角GABA能和ENK能神经元及其参与的局部环路在感觉信息调节中的作用,更重要的是有助于理解病理状态下发生可塑性变化和脊髓背角局部环路重建的机制,从而为脊髓损伤后GABA能和ENK能神经元的修复以及相关的神经系统变性疾病的发病机理和治疗提供新的思路。