为进一步提高猪体细胞核移植的效率,完善猪体细胞核移植的技术程序,本研究从供体细胞的细胞周期调控、受体卵母细胞的体外成熟培养、重构胚的体外培养和体细胞的重编程等方面对猪体细胞核移植的相关影响因素进行了系统研究,取得了如下研究结果。1.采用流式细胞仪检测法对猪成纤维细胞的细胞周期调控方法进行了研究。结果发现,细胞血清饥饿培养(0.5%FBS)24-72小时,显著提高Go/G1期的细胞百分率(92.2～93.7%vs.77.8%,P<0.05)；细胞培养至完全汇合后24-48小时, G0/G1期的细胞比例(94.4%,89.6%)类似于血清饥饿法；血清饥饿培养24小时后,再用10%FBS培养24h,细胞的G0/G1期比例有回复到饥饿培养前的水平(79.4%)。用完全汇合培养法和血清饥饿法培养处理后的体细胞进行核移植,均能获得类似的分裂率(76.2%vs.84.5%,P>0.05)与囊胚率(14.3%vs.12.4%,P>0.05)。结果表明,猪成纤维细胞通过血清饥饿法或完全汇合培养法均能有效的将细胞周期同期化至G0/G1期。2.研究了在体外成熟过程中添加激活素A对卵子核成熟悉和胞质成熟的影响。猪卵母细胞在TCM-199培养液培养40h,期间添加不同剂量的Activin A。结果发现,当添加10ng/ml或100ng/ml时,第一极体排出率相对空白对照组显著提高(60.5%,66.1%vs.50.5%,P<0.05),但孤雌激活胚胎培养的囊胚发育率没有显著差异(P>0.05)。通过红色荧光探针染色后经激光共聚焦显微镜观察作为胞质成熟标志的线粒体排布形态类型,发现经激活素A处理后,相对于空白对照组,处于弥散型分布形态的卵子数目极显著增加(87.9%vs.66.4%,P<0.01),同时圆周型排布(1.8%vs.18.1%,P<0.01)与半周型排布的线粒体排布形态的卵子数目显著下降(8.4%vs.13.8%,P<0.05)。结果表明,猪卵母细胞在体外成熟期间添加激活素A,能促进卵母细胞的核成熟与胞质成熟。3.目前猪胚胎的体外培养大多采用NCSU-23,但其培养效果尚不理想,本研究比较了PZM-3与NCSU-23两种培养液的猪胚胎体外培养效果,以找出一种更适合猪胚胎体外培养的培养液。孤雌激活的胚胎或核移植重构胚分别用PZM-3与NCSU-23培养后,观察胚胎发育情况,并通过实时荧光定量PCR检测不同培养液培养所得核移植囊胚的调亡相关基因BCL-2,印迹相关基因IGF2R(胰岛素生长因子受体Ⅱ),和代谢相关基因PGK1(磷酸甘油酸酯酶Ⅰ)的表达情况。结果发现,孤雌激活胚胎或者核移植重构胚培养于PZM-3和NCSU-23培养液时,其分裂率(82.3%vs.85.2%,P>0.05)和囊胚发育率(26.5%vs.20.0%,P>0.05)没有显著差异；但在PZM-3培养下的孤雌激活胚胎的囊胚细胞总数显著高于NCSU-23培养下的囊胚细胞总数(55.2±6.34vs.36.6±2.82,P<0.05),而核移植囊胚细胞总数在这两种培养基下没有显著差异(51.6±2.7vs.48.2±3.0,P>0.05)。在这两种培养液所得重构胚囊胚相关基因转录水平上,PZM-3培养液的囊胚IGF2R mRNA相对表达丰度显著高于NCSU-23(P<0.05)；而BCL-2与PGK1的表达丰度差异不显著(P>0.05)。由此可见,不同的猪胚胎培养体系能影响胚胎早期发育能力与相关基因表达水平,PZM-3培养液的猪胚胎培养效果优于NCSU-23.4.研究了去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对体细胞核移植重构胚组蛋白乙酰化水平、基因表达水平和胚胎发育能力的影响。结果显示,用500nM的Scriptaid处理重构胚12小时,能显著提高囊胚发育率(21.0%vs.9.7%,P<0.05)。此外,相对于未处理的核移植胚胎(NT组),Scriptaid处理核移植胚胎后能整体提高H3组蛋白18位氨基的乙酰化水平,并且该乙酰化水平与体外受精胚胎(IVF组)乙酰化水平相当。通过检测核移植囊胚相关基因(包括多能性基因OCT4和REXO1,组蛋白乙酰化相关基因HDAC2和HAT1,代谢相关基因PGK1)的转录水平发现,NT囊胚的OCT4与PGK1以及NT-S囊胚的REXO1、HDAC2、HAT1和PGK1表达水平与IVF囊胚的表达水平相当,但NT囊胚的REXO1与HAT1表达水平显著低于IVF和NT-S囊胚的表达水平,而HDAC2的表达水平则显著高于IVF和NT-S囊胚的表达水平。上述结果表明,用Scriptaid处理能提高SCNT重构胚胎发育能力及提高H3K18组蛋白乙酰化水平并影响相关基因表达,并使其趋同于体外受精胚胎的乙酰化水平。