研究背景 鼻咽癌是我国南方五省及东南亚地区高发的头颈部恶性肿瘤之一，其发病的分子机制至今尚未阐明。鼻咽癌病因学研究发现，EB病毒感染、遗传因素和化学致癌物与鼻咽癌的发生发展密切相关，值得注意的是，5-10％的鼻咽癌患者具有家族聚集现象，说明鼻咽癌是一种涉及多个基因改变的遗传性疾病，遗传易感性在鼻咽癌发病过程中可能起着重要作用。 新近，比较基因组杂交和微卫星多态性位点全基因组扫描的研究结果表明，鼻咽癌患者在3号染色体短臂最常发生连续性、非随机性杂合性丢失。3p14-21(FIIIt)、3p21.3-22和3p25-26(VHL)是原发性鼻咽癌杂合性丢失高发频率区。进一步通过微细胞融合单染色体转移的功能性研究证实与鼻咽癌发病密切相关的抑瘤基因可能定位在以3p21.3(D3S1568)为中心的D3S1298-D3S1295区域内。 与此同时，大量的研究也证实人类常见的恶性肿瘤如：肾癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、乳腺癌等常常发生3p21-22的杂合性丢失，甚至发生纯合性丢失。更令人感兴趣的是，通过微细胞融合单染色体转移的功能性研究也证实染色体3p21.3-22(D3S1619-D3S1260)可能存在通过抑制端粒酶活性而抑制肿瘤细胞生长的抑瘤基因。因此染色体3p21-22区域可能存在多个抑瘤基因，其在人类多种恶性肿瘤的发生发展过程中可能起着重要作用。 第一军医大学博士研究生学位论文 目的和方法 本研究采用网上克隆结合定位候选克隆策略，密切结合生物信息学技 术和分子生物学技术，在3P21－22（D351619－D351295）区域克隆鼻咽癌 发病相关的未知抑瘤候选基因，并对该基因进行初步功能分析；同时对该 区域两个己知抑瘤候选基因（RASSFIA和DLECI）进行表达和LOH分析，旨 在全面掌握 3P2 122区域内己知和未知抑瘤候选基因在鼻咽癌发病过程 中的可能作用，为鼻咽癌早期诊断和治疗提供理论依据。 结果 1．鼻咽癌3P21《2区域未知基因表达差异谱的分析 对63个定位于D3S1609－D3S1295间的单拷贝并代表未知基因的ESTS 簇进行网上克隆并获取基因的大片段或全长CDNA序列，通过共管RT－PCR 检测未知基因在4种鼻咽癌细胞株、32例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽部 组织间的表达状况，发现49个UniGene在鼻咽癌和正常鼻咽部组织中有 相同水平的表达；8个UniGene在鼻咽癌和正常鼻咽部组织中均不表达； 2个UniGene在鼻咽癌中表达明显增强；4个UniGene在鼻咽癌中表达明 显减弱，其中HS．27566基因在鼻咽癌细胞和组织中显著低或不表达。 2．鼻咽癌相关新基因Hs．27566的杂合性丢失分析、多组织表达谱和组 织细胞定位的初步探讨 通过微卫星位点的杂合性丢失分析，发现HS．27566低表达的鼻咽癌 组织中有9例存在等位基因的杂合性丢失，提示HS．27566基因的低表达 可能是等位基因杂合性丢失所致。 人类72种组织表达阵列（除鼻咽部组织）Northern blot结果显示该基 因在正常脑组织高表达，而其它正常组织中表达很弱或甚至不能检测到， －3－第一军医大学博士研究生学位论文常见肿瘤细胞株中该基因无表达。利用计算机在ESTS和SAGE数据库中进行电于杂交，结果显示HS．27566基因在正常脑、眼、肺、甲状旁腺和肌肉组织中明显表达，恶性肿瘤该基因的表达明显低于正常组织（H3．14X10”），其中脑瘤（RZ．44X10－’）、视网膜母细胞瘤（HO．0049）、肌源性肿瘤（HO．0123）组织中HS．27566基因存在明显表达下调。 原位分于杂交发现HS．27566基因在IZ例鼻咽癌组织细胞中均不表达，而在6例正常鼻咽部粘膜假复层柱状纤毛上皮的细胞浆明显表达；淋巴细胞和化生的鳞状上皮细胞无表达。 由此叮见，HS．27566基因可能代表一个新的与鼻咽癌发病相关的抑瘤候选基因。3．HS．27566 k咽癌相关新基因的初步功能预测 通过核昔酸和蛋白质序列同源性比对发现HS．27566基因的CDNA序列与2001年5月Genbank公布的KIAAll73基因99％同源，与小鼠cloneMGC：37329 IMAGE：4975643 的核昔酸序列 87％同源，与小鼠（BC024464）RIKEN CDNA ill00llD13基因和 T细胞识别的黑色素瘤抗原多肽氨基酸序列有 88％和 42％相似性。该基回 gDNA全长9．978kb。cDNA全长 1677hp，包含 12个外显子和 11个内含于，编码 504个氨基酸，分于量为 56．7KDa，理论等电点为6．67，平均疏水指数为：0．380358o 采用MLTC软件预测多肽二级结构，61．90％的氨基酸形成a螺旋，9．33％的氨基酸组成延伸主链，9．33％的氨基酸形成 p转角，28．77％的氨基酸组成无规卷曲。 采用SOSUI、SSISS－PROT、HMMTOP、TOPPRED和SMART软件预测显示该氨基酸序列是一个完整的跨