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第一部分肿瘤相关巨噬细胞的诱导及鉴定目的:通过体外诱导确立人肿瘤相关巨噬细胞(TAM),并分析其表型特征。方法:一般观点认为,普通巨噬细胞为M1型巨噬细胞,TAM为M2型巨噬细胞。本部分首先运用佛波酯(PMA)诱导人单核细胞株THP-1细胞贴壁分化成巨噬细胞(PMA only型),运用流式细胞分析仪检测巨噬细胞(PMA only型)表面分子CD14的表达水平,然后运用人白细胞介素4(IL-4)或脂多糖(LPS)分别刺激巨噬细胞极化成为M2或M1型巨噬细胞;半定量RT-PCR法检测不同组巨噬细胞IL-6m RNA的表达水平,ELISA实验分析不同组巨噬细胞TNF-α蛋白的表达情况。结果:THP-1细胞被PMA诱导后,其细胞表面CD14的表达水平明显增高。和LPS诱导极化的M1型巨噬细胞相比,单独运用PMA诱导的巨噬细胞(PMA only型)和IL-4诱导的M2型巨噬细胞其IL-6m RNA的表达和TNF-α蛋白的表达水平明显降低。结论:成功诱导了巨噬细胞,其CD14高表达且偏向于M2型巨噬细胞;成功诱导建立了TAM,其特征为M2型巨噬细胞,表现为IL-6及TNF-α低表达。第二部分肿瘤相关巨噬细胞对肺腺癌细胞迁移、侵袭的影响及初步机制研究目的:探讨肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对人肺腺癌A549细胞迁移和侵袭的影响,并初步分析其潜在的分子机制。方法:将肺腺癌A549细胞与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过transwell小室进行间接共培养,然后收集其共培养液用作后续实验。用划痕愈合实验检测肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对A549细胞迁移的影响;用transwell侵袭实验检测肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对A549细胞侵袭的影响;用半定量RT-PCR,q RT-PCR和western blot法检测肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对A549细胞VEGF-C,VEGF-D和VEGFR3表达的影响;用免疫组化法(IHC)检测VEGFR3在肺腺癌组织中的表达分布。在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)微环境中,VEGFR3的抑制剂(MAZ51)抑制VEGFR3后,用划痕愈合实验和transwell侵袭实验分别检测A549细胞的迁移、侵袭能力。结果:肿瘤相关巨噬细胞(TAM)促进肺腺癌A549细胞的迁移和侵袭。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)提高肺腺癌A549细胞VEGF-C和VEGFR3蛋白的表达。免疫组化(IHC)实验证实VEGFR3主要在人肺腺癌细胞中高表达。抑制VEGFR3后明显降低肺腺癌A549细胞的迁移和侵袭。结论:肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过提高A549细胞VEGFR3的表达从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。第三部分肿瘤相关巨噬细胞介导的VEGFR3对肿瘤增殖的影响目的:探讨肿瘤相关巨噬细胞(TAM)介导的人肺腺癌细胞VEGFR3的表达对肺腺癌细胞增殖的影响,并探究其潜在的分子机制。方法:用MTT实验分析在不同浓度梯度的VEGFR3抑制剂(MAZ51)作用下,其共培养液中A549细胞的活力变化;流式细胞分析仪检测在MAZ51作用下,共培养A549细胞的凋亡情况;细胞集落形成实验分析MAZ51对共培养A549细胞增值的抑制作用。Western blot分析法检测在MAZ51作用下共培养A549细胞中MAPK信号通路以及P53,PTEN,BCL-2和MMP-2蛋白表达变化;半定量RT-PCR法检测ERK信号通路抑制剂U0126抑制ERK信号通路及si RNA干扰P53和PTEN的表达后,共培养A549细胞中P53和PTEN m RNA的表达变化;MTT实验分析si RNA干扰P53和PTEN的表达后,在MAZ51作用下,共培养A549细胞的活力变化。结果:MAZ51降低共培养A549细胞的增殖活力,促进其凋亡,降低其细胞集落形成数。Western blot实验证实MAZ51能够抑制p-ERK的活性,提高抑癌蛋白P53,PTEN的表达,降低抗凋亡蛋白BCL-2和促侵袭蛋白MMP-2的表达。抑制ERK信号通路后,P53和PTEN m RNA的表达明显提高。干扰P53和PTEN的表达后,提高了共培养A549细胞的增殖活力。结论:抑制VEGFR3后,可通过降低p-ERK的活性,提高抑癌蛋白P53和PTEN的表达,进而抑制肿瘤细胞的增殖活力。第四部分肿瘤相关巨噬细胞介导的VEGFR3对肿瘤药物敏感性的影响目的:探讨肿瘤相关巨噬细胞(TAM)介导的人肺腺癌细胞VEGFR3的表达对肺腺癌A549细胞化疗药物敏感性的影响,为临床肺腺癌的治疗提供新的策略。方法:在体外,用流式细胞分析仪检测VEGFR3抑制剂(MAZ51)与化疗药物多柔比星在不同的药物组合方案中,其共培养液中肺腺癌A549细胞凋亡的情况。在体内,构建裸鼠皮下成瘤模型,检测VEGFR3抑制剂(MAZ51)对肺腺癌化疗药物敏感性的影响。结果:体外实验证实,与单独运用MAZ51、多柔比星或者两者同时运用相比,先用MAZ51处理肿瘤细胞,而后用多柔比星处理肿瘤细胞后,其细胞的凋亡比例比单用MAZ51、多柔比星或者同时运用两种药物更加明显。体内实验证实,与单独运用多柔比星相比,MAZ51与多柔比星联合运用后,其裸鼠肿瘤的生长体积明显降低。结论:抑制VEGFR3后可以增强药物多柔比星对肺腺癌的化疗敏感性。