糖尿病是以胰岛素分泌不足或外周组织对胰岛素抵抗引起葡萄糖代谢紊乱血糖升高为主要特征的一类代谢性疾病,然而胰岛素依赖型糖尿病是目前一种无法完全治愈的慢性疾病。糖尿病及并发症需体外注射胰岛素药物治疗。目前,研究发现通过胰腺组织或胰岛细胞移植是一种很有前景的治疗方案。然而人类胰腺供体组织来源匮乏,人们将移植替代物转向异种动物-猪。猪胰岛素结构与人胰岛素结构高度同源并且能够调节胰岛细胞生理活性干预血糖。研究表明胰腺干细胞具有较强的自我更新能力及多向分化潜能,可能是获得大量胰岛β细胞的最佳种子细胞。因此,近年来人们将研究重点转移到猪胰腺干细胞。然而在机体成熟胰腺组织内,胰腺干细胞数量相对较少且大多数增殖缓慢。经典Wnt信号通路中的Wnt3a分子,其在胚胎发育、氧化应激、线粒体形态膜电位及干细胞增殖分化过程中发挥着重要的调控作用,参与基因转录、细胞迁移粘附、细胞衰老凋亡、细胞极化和自噬等重要生理过程。然而Wnt3a分子是否参与胰腺干细胞的增殖与分化一直未见可靠报道。本研究在实验室已有基础上,探讨稳定表达Wnt3a和Dox诱导Wnt3a表达对猪胰腺干细胞生物学特性影响及其可能的分子机制。研究结果表明,稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞具有胰腺干细胞相关生物学特性,激活β-catenin介导的经典Wnt信号通路,过表达Wnt3a引起猪胰腺干细胞氧化应激水平降低、调节线粒体膜电位转换,继而保护线粒体生理功能,β-catenin靶向降低活性氧水平、抑制猪胰腺干细胞凋亡。建立Dox诱导Wnt3a表达调控猪胰腺干细胞系统,Wnt3a表达受Dox时间和剂量依赖性调控,Dox诱导Wnt3a表达促进猪胰腺干细胞增殖。构建稳定表达自噬标记LC3猪胰腺干细胞,建立体外评估自噬活性猪胰腺干细胞模型,一定程度诱导自噬促进猪胰腺干细胞增殖。在糖尿病发生和胰腺干细胞发育分化过程中,氧化应激和胰岛β细胞凋亡及自噬都起到至关重要的作用,该研究发现Wnt3a可能通过激活Wnt/β-catenin通路调控猪胰腺干细胞的自我更新和抗凋亡。1.稳定表达Wnt3a促进猪胰腺干细胞增殖并抑制其凋亡将重组真核表达载体p IRES2-Ac GFP-Wnt3a转染猪胰腺干细胞,在经G418抗生素压力筛选、纯化得到稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞株。经检测,该细胞稳定携带Wnt3a基因且呈绿色荧光蛋白阳性表达。通过细胞群体倍增生长曲线测定、细胞周期、Brd U标记、QRT-PCR、Western blotting等方法分析显示,稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞具有典型间充质干细胞和胚胎干细胞的部分生物学特性并促进细胞增殖,同时表达胰腺干细胞相关标记。利用双荧光素酶报告系统和蛋白免疫印迹方法,发现Wnt3a激活经典Wnt信号通路的β-catenin表达水平。利用流式细胞术和线粒体膜电位检测,发现经典Wnt信号通路具有保护线粒体膜电位的功能、引起氧化应激水平降低;而当加入Dkk1抑制Wnt通路后,其结果与Wnt3a超表达正好相反。通过流式细胞仪检测细胞凋亡发现,抑制Wnt通路引起细胞凋亡率上升,而稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞的凋亡率明显降低(前者凋亡率是后者的4倍)。该结果揭示稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞通过激活β-catenin抑制猪胰腺干细胞凋亡。2.Dox诱导Wnt3a表达促进猪胰腺干细胞增殖将Wnt3a基因克隆至p CDNA4T/O成功构建诱导表达载体p CDNA4T/O-Wnt3a。将质粒p CDNA6T/R和p CDNA4T/O-Wnt3a共同转染猪胰腺干细胞,经博莱霉素和杀稻瘟菌素抗生素筛选得到Dox诱导Wnt3a表达猪胰腺干细胞,且Dox诱导绿色荧光蛋白表达。应用免疫荧光、QRT-PCR、流式细胞术、Western blotting等方法分析显示,Dox诱导Wnt3a表达的猪胰腺干细胞受Dox时间和剂量调控,并在细胞上清液中检测到有分泌蛋白-Wnt3a。Dox诱导Wnt3a表达猪胰腺干细胞增殖和分化相关标记:c-Myc、PCNA、PDX1和Glut2。通过细胞周期、Brd U标记和蛋白免疫印迹等方法分析显示,Dox诱导Wnt3a表达,通过c-Myc和PCNA蛋白表达水平升高促进细胞增殖;而当加入Dkk1后通过下调β-catenin蛋白表达水平抑制细胞增殖。该结果揭示Dox诱导Wnt3a表达,激活β-catenin靶向c-Myc和PCNA蛋白表达水平升高促进细胞增殖。该系统为研究Wnt3a调控胰腺干细胞的自我更新分子机制提供了理想细胞模型和技术平台。3.诱导自噬促进猪胰腺干细胞增殖将慢病毒载体p CAG-GFP-LC3和辅助质粒p VSV-G及p SPAX2转导293T细胞,获取目的基因(GFP-LC3)慢病毒病毒液。将目的基因病毒液转导猪胰腺干细胞,经嘌呤霉素抗生素压力筛选得到稳定表达自噬标记LC3的猪胰腺干细胞株。经PCR、Western blotting和流式细胞术检测,该细胞稳定携带LC3基因且呈绿色荧光蛋白表达阳性。经免疫荧光染色分析,该细胞表达间充质干细胞标记CD90、Vimentin,表达细胞增殖标记PCNA、c-Myc,同时表达胰腺干细胞分化标记PDX1和自噬溶酶体底物标记p62。应用血清饥饿、氯喹、血清饥饿+氯喹和正常对照分别刺激表达自噬标记LC3的猪胰腺干细胞,激光共聚焦技术分析评价其对自噬小体的影响,结果发现血清饥饿诱导猪胰腺干细胞自噬,而氯喹显著抑制自噬。进一步利用流式细胞仪分析细胞周期和Brd U标记细胞分析发现,诱导自噬引起猪胰腺干细胞细胞周期S期细胞比例升高、促进细胞增殖,而抑制自噬则引起猪胰腺干细胞增殖减缓。该结果揭示一定程度诱导自噬促进猪胰腺干细胞增殖,自噬发生可能决定猪胰腺干细胞的自我更新与分化的命运。该研究为进一步阐明Wnt3a如何通过调节自噬、调控胰腺干细胞自我更新的分子机制等研究提供了理想的细胞模型平台。