草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国淡水养殖的主要品种之一,具有重要的经济价值。但是由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病死亡率极高,给草鱼养殖业造成巨大的损失。GCRV基因组由11条分节段的双链RNA组成,编码11-12个蛋白,其中病毒的外衣壳蛋白由于具有较好的免疫原性,常作为亚单位疫苗制备的抗原蛋白。本论文以Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒分离株GCRV106为研究对象,基于杆状病毒表达系统制备了该病毒外衣壳蛋白VP35和VP4的亚单位疫苗,并通过注射和口服两种免疫方式对疫苗的免疫保护效果进行评价。主要研究结果如下:1.重组蛋白的表达及其对稀有鮈鲫的免疫保护效果研究（1）以GCRV 106病毒基因组为模板,通过PCR扩增获得VP35、VP4和VP35-VP4蛋白基因。利用杆状病毒表达系统构建供体质粒p Fast Bac-VP35、p Fast Bac-VP4和p Fast Bac-VP35-VP4并在SF9细胞中表达融合蛋白VP35和VP4。Ni柱亲和层析纯化重组蛋白VP35、VP4和VP35-VP4后,BCA测定浓度分别为0.4 mg/m L、0.3 mg/m L和0.3 mg/m L。以每尾3μg蛋白腹腔注射免疫稀有鲫。（2）实时荧光定量PCR检测免疫相关基因的表达。结果表明免疫组VP35、VP4和VP35-VP4中的Ig M、TNF-α、My D88、NF-Kb、IL-1β、Mx和TLR3的表达水平在免疫后不同时间点在肝、脾和肾中都有不同程度的上调,且三个免疫组变化趋势相同。与对照组相比,IL-1β和TLR3在脾脏和肾脏的表达量在第3 d显著上调并达到峰值,上调2-6倍（P<0.01）。肝脏和脾脏中Mx的相对表达量在第3 d开始上调,在第5 d达到最高值,上调3-6倍（P<0.01）。NF-k B和TNF-α在肝脏、脾脏和肾脏中在第14 d达到峰值,上调4-9倍（P<0.01）。Ig M第7 d开始上调,并在第21 d达到峰值,在肝脏、脾脏和肾脏中分别上调8-20倍（P<0.01）。（3）免疫后21 d攻毒,结果表明重组蛋白r VP35、r VP4和r VP35-VP4均可不同程度保护稀有鲫免受GCRV的感染,免疫保护率分别为33%、60%和67%。2.口服疫苗的制备及其对草鱼的免疫保护效果研究（1）利用Bac-to-Bac家蚕杆状病毒表达系统在Bm E细胞和5龄家蚕中表达重组蛋白r VP35-VP4。收集感染r Bm Bac-VP35-VP4 120 h后的5龄家蚕,真空冷冻干燥成冻干粉,以5%的比例添加到饲料中口服免疫草鱼。（2）红白细胞计数结果表明在免疫后第14、21和28 d,免疫组草鱼外周血中的白细胞的数量与对照组相比增加了1.4-1.7倍（P<0.05）。白细胞分类计数结果表明在免疫后第14 d,白细胞中的中性粒细胞和单核细胞的百分比增加并且显著高于对照组（19.82±1.18%,10.12±1.18%）（P<0.05）,随后在28 d下降,但此时在白细胞中淋巴细胞的百分比显著增加（93.14±0.82%）（P<0.05）。ELISA的实验结果表明,免疫组的Ig M抗体滴度在免疫后两周显著升高,在第28 d达到最高水平,OD₄₅₀为0.71±0.04（P<0.01）)。实时荧光定量PCR检测结果表明,免疫相关基因IFN I、TLR22、IL-1β、MHC I、Mx和Ig M的表达水平在口服免疫草鱼后不同时间点显著上调。与对照组相比,肝脏和脾脏中的IFN I在免疫后21 d开始上调并达到峰值,分别上调2.2倍（p<0.05）和2.8倍（p<0.01）。脾脏中的IL-1β和MHCⅠ在第21 d开始上调并达到峰值,分别上调2.8倍（P<0.01）和2.2倍（P<0.05）。肝脏和后肠中的Ig M第14 d开始上调,在21 d达到最高值,分别上调3.1倍（P<0.01）和6.5倍（P<0.01）,而在肾脏和脾脏中,分别在第14 d和21 d时开始上调,在28d时达到峰值,上调9倍（p<0.01）和6.8倍（p<0.01）。（3）攻毒试验结果表明,口服家蚕冻干粉疫苗的草鱼免疫保护率为56%,显著高于对照组的4%（P<0.01）。以上结果表明口服家蚕冻干粉疫苗的草鱼可被诱导产生免疫应答,并有效保护草鱼免受GCRV的感染,该研究为GCRV口服亚单位疫苗的研制奠定基础。