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蝎毒素是研究蛋白质结构和功能关系的极好模型,同时,它作为十分有价值的探针被广泛应用于相关靶离子通道分子调控机理的研究。其中,蝎昆虫神经毒素是一类对昆虫有专一性麻痹致死作用,而对哺乳动物无害或毒性很小的多肽,因而被广泛应用于生物杀虫剂和抗虫转基因植物的研究。几丁质是许多鳞翅目等害虫表皮和消化道内壁的重要组成部分。昆虫在蜕皮时分泌几丁质酶以分解几丁质,并蜕掉旧皮。如果将昆虫几丁质酶基因导入植物,使其在植物中持续表达,就会阻止取食害虫的正常发育,从而起到保护植物的作用。本研究在原核生物系统中表达了一种蝎昆虫毒素和一种昆虫几丁质酶并分别进行了纯化,进而利用获得的蝎毒素与几丁质酶制备了多克隆抗体。这两种抗体的制备,使外源蝎毒基因与几丁质酶基因在转基因植物中表达水平的检测成为可能,为转基因抗虫植株的进一步筛选与评价奠定了基础。本研究的主要进展如下: 本研究首先将东亚钳蝎Buthus martensii Karsch昆虫神经毒素基因BmK IT构建于原核表达载体pTWIN1中,得到的重组表达质粒pTWIN1-BmK IT转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达获得可溶性的融合蛋白CBD-intein-Bmk IT。经过两次离子交换层析和一次凝胶过滤,得到电泳纯的Bmk IT融合蛋白。将融合蛋白拌入棉铃虫饲料中进行虫饲实验,结果表明原核表达的融合蛋白具有生物学活性。 同时将BmK IT基因构建于原核表达载体pET-28a中,得到的重组表达质粒pET-28a-BmK IT转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达获得包涵体蛋白His6-BmK IT。采用切胶回收的方法切割回收包涵体,并将回收产物免疫新西兰大白兔,ELISA检测抗体效价达1:100,000。Western blot检测证明抗体特异性良好。用此多克隆抗体可以检测转基因植物中外源蝎毒蛋白BmK IT的表达量。