自1950s始,抗生素类促生长饲料添加剂广泛用于养猪生产,在改善动物健康、提高动物生产性能的同时,也加剧了细菌的抗生素耐药问题。欧盟于2006年全面禁止抗生素用于动物促生长,饲料高铜成为一个广泛采用的替代措施,欧盟规定在开食至12周龄仔猪饲料中可添加170-175 mg·kg-1的铜。但是近年来越来越多的研究发现,饲料高铜有可能通过选择与耐药基因共享遗传元件的铜抗性基因,而增强对动物肠道和环境中耐药菌的选择,促进细菌耐药性的维持与传播,仔猪日粮中高铜使用的合理性再次引起广泛关注。长时间采食高铜会产生铜中毒,危害动物健康。我国当前养猪生产中以促生长为目的抗生素和高铜添加普遍同时存在,高铜对猪生长健康和猪源细菌耐药性的影响也因此更为复杂。本文应用微生物、离子和代谢组学技术,综合评价日粮铜水平对大鼠和苏淮哺乳仔猪生长及肠道微生物的影响,为我国养猪业后抗生素时代饲料中铜的合理添加提供科学依据。1日粮铜水平对大鼠生长及肠道健康的影响本研究选择60只雄性SD大鼠随机分为三组,分别饲喂八周的6、120和240 mg·kg-1铜水平纯合日粮,记录大鼠采食和体重数据、观察肠道形态、测定血清生化指标及肠道组织氧化标记物和抗氧化酶水平,以研究日粮铜水平对大鼠生长和肠道健康的影响。试验结果表明,高铜(120和240 mg·kg-1)日粮前四周有促进大鼠平均日增重的趋势(P=0.07),但后四周有降低平均日增重的趋势(P=0.08),平均日采食量和饲料转化效率表现相同的变化规律,但差异不显著。240 mg·kg-1日粮铜显著提高了大鼠血清中胰岛素、胃饥饿素、促炎因子TNF-α和IL-6的水平(P<0.05),但日粮铜水平对大鼠血液铜、铜转运相关蛋白等的含量无显著影响。日粮高铜极显著提高了大鼠回、结肠食糜的铜含量(P<0.01)。240 mg·kg-1日粮铜显著降低了大鼠回肠绒毛高度和隐窝深度,6和240 mg·kg-1日粮铜显著升高了大鼠回肠V/C比值(P<0.05)。日粮高铜(120和240 mg·kg-1)降低了大鼠空、回肠组织中NO水平(P<0.05)、回肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)(P<0.05)、过氧化氢酶(P=0.08)和谷胱甘肽(GSH)(P=0.07)的水平,降低了空肠组织中铜锌超氧化物歧化酶水平(p=0.07),但提高了空肠组织中氧化型谷胱甘肽(GSSG)水平(P<0.05)。综上所述,日粮高铜(120和240 mg·kg-1)对大鼠生长的影响呈现短期促进、长期抑制的趋势。高铜(120和240 mg·kg-1)日粮的长期摄入使得铜元素在大鼠肠道食糜中显著积累,这种积累改变小肠组织氧化还原状态,降低了肠道组织的抗氧化能力,打破活性氧物质产生与清除之间的平衡,引起大鼠机体炎症反应,不利于大鼠的健康。2日粮铜水平对大鼠肝脏铜离子代谢和氧化还原平衡的影响肝脏是代谢和储存铜的主要器官,为研究日粮铜水平对大鼠肝脏铜离子代谢和氧化还原状态的影响,本章对第一章的试验大鼠进行肝脏组织形态学分析、铜含量、铜转运相关基因mRNA表达水平以及氧化标记物和抗氧化酶水平的测定。结果表明,日粮高铜(120和240 mg·kg-1)对大鼠肝脏组织细胞产生较明显的结构破坏,肝脏细胞出现胞浆浑浊以及细胞间隙变大出现空洞。日粮高铜(120和240 mg·kg-1)提高总超氧化物歧化酶(T-SOD)(P<0.05)、锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)(P<0.05)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)(P<0.05)及氧化型谷胱甘肽(GSSG)(P<0.05)水平;120 mg·kg-1日粮铜提高铜锌-超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)水平(P<0.05)。240 mg·kg-1日粮铜下调铜转运蛋白(Ctr1)基因mRNA表达水平(P<0.05);120 mg·kg-1日粮铜上调铜锌超氧化物歧化酶(Soad1)(P<0.05)、金属硫蛋白(Mt1a)(P<0.05)、铜蓝蛋白(Cp)(P<0.05)及铜锌超氧化物歧化酶伴侣蛋白(Ccs)(P=0.09)基因mRNA表达水平。相关性分析结果表明,肝脏铜含量与铜锌超氧化物歧化酶伴侣蛋白(Ccs)、铜蓝蛋白(Cp)基因的mRNA表达水平、总超氧化物歧化酶(T-SOD)及铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)水平显著正相关(P<0.05),与血清中IL-6水平显著负相关(P<0.05)。综上所述,大鼠长期摄入高铜(120和240 mg·kg-1)日粮,对肝脏细胞造成形态学损伤,120 mg·kg-1日粮铜上调肝脏组织金属硫蛋白(Mt1a)和铜蓝蛋白(Cp)基因表达水平,并提高肝脏组织抗氧化能力(CuZn-SOD和GSSG水平升高),提高大鼠对持续日粮高铜的适应性和耐受性,维持肝细胞内铜的稳态。240 mg·kg-1日粮铜只能下调肝细胞Ctr1基因表达水平,不能通过其它适应性基因表达调控来提高肝细胞对高铜的耐受性,进而导致肝细胞形态学损伤严重。3日粮铜水平对大鼠肠道菌群的影响及其与机体炎症和氧化还原平衡的相关性大鼠长时间采食高铜日粮,食糜中高浓度铜环境对肠道微生物也存在影响,本章采集第一章中试验大鼠粪便样品,运用16S rRNA基因高通量测序技术研究日粮铜水平对大鼠粪样微生物的影响。试验结果表明,日粮高铜(120和240 mg·kg-1)提高微生物丰度(ACE和Chaol)和多样性(Shannon)指数(P<0.05),Simpson指数存在降低趋势(P=0.07)。相对于低铜(6 mg·kg-1)处理组,日粮高铜(120和240 mg·kg-1)提高产丁酸(多尔氏菌属Dorea、布劳特氏菌Blautia、粪球菌属Coprococcus等)菌群、肠道健康相关菌群(克里斯藤森菌科Christensenellaceae、颤杆菌克属Oscillibacter、别样杆菌属Alistipes)及潜在病原菌(丹丝毒菌科Erysipelotrichaceae和紫单胞菌属Parabacteroides)相对丰度(P<0.05)。相关性结果表明,粪样微生物丰度和多样性指数与回、结肠食糜铜含量及血清TNF-α显著正相关(P<0.05),与空肠一氧化氮(NO)水平显著负相关(P<0.05);微生物丰度指数与回肠抗氧化酶(T-SOD和Mn-SOD)水平显著负相关(P<0.05)。Anaerotruncus相对丰度与血清TNF-α显著正相关(P<0.05),与空肠一氧化氮(NO)及回肠抗氧化酶(T-SOD和Mn-SOD)水平均显著负相关(P<0.05),Parasutterella相对丰度的相关性与之相反;OTU402(粪球菌属Coprococcus)与OTU52(普通拟杆菌Bacteroides vulgatus)相对丰度与血清TNF-α水平显著正相关(P<0.05);OTU99(紫单胞菌属PParabacteroides)及 OTU273(别样杆菌属Alistipes)相对丰度与血清TNF-α水平显著负相关(P<0.05);布劳特氏菌Blautia(OTU88)与OTU69(克里斯藤森菌科Christensenellaceae)相对丰度与空、回肠一氧化氮(NO)水平及回肠抗氧化酶(T-SOD和Mn-SOD)显著正相关(P<0.05);OTU368(布劳特氏菌 Blautia)、OTU402(粪球菌属 Coprococcus)及 OTU145(颤杆菌克属 Oscillibacter)相对丰度与空、回肠一氧化氮(NO)水平及回肠T-SOD显著负相关(P<0.05)。综上所述,长时间摄入高铜(120和240 mg·kg-1)日粮,大鼠回、结肠食糜中铜显著积累,提高粪样微生物丰度和多样性,改变某些优势菌群丰度,导致菌群结构和组成改变,打破大鼠肠道组织氧化还原平衡状态,引起大鼠机体炎症反应,对大鼠健康不利。4无抗日粮铜水平对苏淮哺乳仔猪生长健康及离子组谱的影响本章研究以苏淮哺乳仔猪作为动物模型,探究无抗日粮铜水平对苏淮哺乳仔猪生长性能、血清生化指标和机体离子平衡的影响,并通过相关性分析研究日粮铜水平对仔猪健康的影响。试验选择来自18头二胎次母猪的哺乳阶段14日龄仔猪172头,分为6、20和300 mg·kg-1(CuSO4)三个处理组。饲喂周期为仔猪14日龄至40日龄。结果表明,相对于低铜(6 mg·kg-1)组,日粮高铜(300 mg·kg-1)提高仔猪平均日增重(P<0.05)及平均日采食量(P<0.05)(14至28日龄),在29至40日龄降低仔猪平均日增重(P<0.05)和饲料转化率(P<0.05)。仔猪腹泻率随着日粮铜水平增加显著下降(P<0.05)。相对于低铜(6 mg·kg-1)组,日粮20 mg·kg-1铜水平降低丙二醛(MDA)(P<0.05)、谷丙、谷草转氨酶(P<0.05)及总胆酸(P<0.05)水平;日粮高铜(300 mg·kg-1)提高生长激素(GH)(P<0.05)、降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(P<0.05)、总胆酸(P<0.05)、白蛋白(P<0.05)及金属硫蛋白(P<0.05)水平,超氧化物歧化酶(SOD)有降低趋势(P=0.09)。相对于低铜(6 mg·kg-1)组,日粮20 mg·kg-1铜水平提高毛发及血清Mg含量(P<0.05),日粮高铜(300 mg·kg-1)提高毛发Na和K、血清Ca和P及粪样Cu含量(P<0.05);相对于20 mg·kg-1铜水平,日粮高铜(300 mg·kg-1)提高毛发Na和K含量(P<0.05),降低毛发Mg、P及Mn含量(P<0.05)。元素间相关性结果表明各元素之间均显著正相关(P<0.05)。相关性模式结果表明,饲喂300 mg·kg-1铜水平日粮仔猪毛发中Ca、Mg、P、Na、K与Cu、Mn、Zn之间相关性消失。毛发Na和K含量与IGF-1和总抗氧化能力(T-AOC)显著正相关(P<0.05),与TNF-α、金属硫蛋白(Metallothionein)显著负相关(P<0.05);毛发、血清及粪样Fe含量与金属硫蛋白(Metallothionein)、谷丙转氨酶(ALT)及白蛋白(Albumin)显著正相关(P<0.05),与丙二醛(MDA)显著负相关(P<0.05);毛发、血清及粪样Cu含量与丙二醛(MDA)、总胆汁酸(TBA)及尿素氮(BUN)显著负相关(P<0.05)。综上所述,日粮高铜(300 mg·kg-1)短时间内促进了哺乳仔猪生长,仔猪的肝、肾功能和氧化还原平衡状态受损;20 mg·kg-1日粮铜组仔猪饲料转化率较高,腹泻率也在可接受范围,机体的抗氧化能力和肝、肾功能改善,满足仔猪营养需求;日粮高铜(300 mg·kg-1)改变Na、K和Fe、Cu、Zn体内平衡状态,损伤机体氧化还原平衡状态和肝肾功能。5无抗日粮铜水平对苏淮哺乳仔猪肠道菌群的影响及其与机体炎症和氧化还原平衡的相关性肠道微生物在影响动物宿主健康方面存在重要的作用。本章试验设计同第四章,采集39日龄仔猪粪便样品,利用16s rRNA测序分析粪样微生物菌群。仔猪粪样微生物菌群分析结果显示,日粮铜水平对粪样微生物的丰度和多样性指数无显著影响,粪样中肠球菌(Enterococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸杆菌(Lactobacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus)相对丰度均无显著影响(P>0.05)。高铜(300 mg·kg-1)日粮提高纤维杆菌门(Fibrobacteres)相对丰度及链球菌(Streptococcus)相对丰度(P<0.05),降低产丁酸菌粪球菌属(Coprococcus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)及罗氏菌属(Roseburia)相对丰度(P<0.05)。仔猪粪样微生物与血清代谢产物相关性分析结果表明,毛螺菌科Lachnospiraceae(NK4A136和PCS020 group)相对丰度与丙二醛(MDA)、白蛋白(ALB)显著正相关(P<0.05),与总抗氧化能力(T-AOC)显著负相关(P<0.05);瘤胃球菌属(Ruminococcus)相对丰度与血清TNF-α显著正相关(P<0.05);盐单胞菌属(Halomonas)及产甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)相对丰度与血清TNF-α、白蛋白(ALB)及尿素氮(BUN)显著正相关(P<0.05);棒状杆菌属(Corynebacterium)相对丰度与血清TNF-α及白蛋白(ALB)显著正相关。综上所述,高铜(300 mg·kg-1)日粮显著降低了仔猪肠道中产丁酸菌相对丰度,潜在病原菌(Streptococcus)的相对丰度上升,高铜(300 mg·kg-1)日粮改变了仔猪肠道微生物的结构和组成,进而改变机体炎症反应、氧化还原状态以及肝肾功能,不利于仔猪健康。6无抗日粮铜水平对苏淮哺乳仔猪粪样代谢产物的影响及其与机体离子平衡和肠道微生物相关性本章试验利用非靶向代谢组学手段研究无抗日粮铜水平对苏淮哺乳仔猪粪样代谢产物的影响。试验设计同第四章,采集39日龄仔猪粪便样品用于代谢组学分析。代谢组分析共检测到91种代谢产物,三个处理组之间差异代谢产物47种,日粮低铜(6 mg·kg-1)上调粪样中必需氨基酸(亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和精氨酸)及条件性必需氨基酸(脯氨酸和酪氨酸),单糖(阿拉伯糖和甘露糖)和磷酸糖(葡萄糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸)水平(P<0.05)。日粮铜水平影响碳水化合物代谢(半乳糖代谢、糖异生)及含氮小分子代谢(蛋白质生物合成、尿素循环、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和蛋氨酸代谢)(P<0.05)。毛发中Na、K和Cu含量与嘌呤代谢(肌苷)、苯丙氨酸和酪氨酸代谢及线粒体电子传递链(延胡索酸)显著负相关(P<0.05);血清中Ca、Mg和P含量与尿素循环以及精氨酸和脯氨酸代谢(鸟氨酸和精氨酸)显著负相关(P<0.05);粪样中Cu含量与甜菜碱代谢(蛋氨酸)及泛酸和辅酶A生物合成(泛酸)显著负相关(P<0.05)。普雷沃氏菌(Prevotellaceae UCG-004)相对丰度与半乳糖代谢(葡萄糖、甘露糖、肌醇)及葡萄糖-丙氨酸循环(葡萄糖)显著正相关(P<0.05);粪球菌属(Coprococcus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)及瘤胃球菌属Ruminococcus(OTU18)相对丰度与碳水化合物代谢途径(柠檬酸循环、苹果酸穿梭、糖异生、磷酸戊糖途径以及糖酵解)显著正相关(P<0.05);链球菌属(Streptococcus)相对丰度与含氮小分子代谢(蛋白质生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸)显著负相关(P<0.05)。综上所述,日粮铜水平影响仔猪粪样中代谢产物水平,改变后肠代谢物组成和结构。低铜(6mg·kg-1)日粮降低了仔猪蛋白质和碳水化合物的消化吸收利用率。高铜(300mg·kg-1)组仔猪毛发、血清和粪样中元素水平变化改变机体离子平衡,影响碳水化合物、脂肪和氨基酸以及能量代谢。肠道中菌群丰度的改变,也可改变仔猪后肠微生物代谢通路,改变仔猪机体代谢稳态,而影响仔猪健康。