背景原发性肝癌(primary hepatic carcinoma, PHC)是在世界范围发病率较高的恶性肿瘤。PHC由肝细胞癌和胆管细胞型肝癌组成。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)已成为一个主要的健康问题,在2002年全世界新增62.6万患者,排名在第六位。HCC在我国消化系统恶性肿瘤的发病中居第3位,在我国肝细胞癌居恶性肿瘤死亡率的第二位。胆管细胞型肝癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICCA)是来源于不同胆管细胞的上皮癌,约占胆管细胞癌10%。进展型的胆管细胞型肝癌有很差的预后,其存活的中位数<24个月。根治性治疗有外科切除和肝脏移植,但是大部分患者都是在进展期被发现的,很难进行外科手术。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)是现在较好的一个在肝硬化患者中被推荐检测HCC的血清标志物[1]。由于它的敏感度只有39-64%,特异度为76-91%[2-4],AFP并不是一个理想的筛选检测指标。糖链抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9, CA199)是在诊断胆管细胞型肝癌中使用最广泛的。CA199对胆管细胞型肝癌并不具有特异性。CA199在胰腺癌、直肠癌、胃癌和妇科恶性肿瘤中升高。在与非原发性硬化性胆管炎患者比较鉴别中,以血清CA199超过100U／mL为标准,诊断胆管细胞癌敏感度为53%。因此,胆管细胞型肝癌的诊断需要寻找更好的血清学标志物。高尔基蛋白73(Golgi protein-73, GP73)是一个新认识的HCC血清标志物。GP73在很多组织的正常上皮细胞表达。它的功能还不清楚。在分离出的正常肝细胞中GP73是减少或则正常表达,但是在病毒和非病毒肝疾病的肝细胞[5]和HCC[6]是上调的。这表明GP73可能作为一个潜在的早期检测HCC标志物。基于它在肝脏疾病的表现和GP73在亚洲人尤其中国人的HCC研究较少,而且在胆管细胞型肝癌中尚未见研究。本研究探讨GP73蛋白能否在中国肝脏病患者及胃癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌患者和健康人对照组血清中检测到并比较,比较HCC的血清GP73蛋白和AFP,ICCA的血清GP73蛋白和CA199。同时采用nested PCR方法检测肝脏病患者的血清GP73 mRNA情况。方法1蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测GP73蛋白的表达实验分为9组,乙肝相关性肝细胞癌组、慢性乙型肝炎组和健康人对照组各31例,乙肝相关性肝硬化组20例,另外胆管细胞型肝癌13例,胃癌组、结肠癌组、乳腺癌组各10例,胰腺癌组6例。从各实验对象抽取外周静脉血5ml,测定出样品的蛋白质含量,然后将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳,加入一抗,二抗,染色,转膜观察结果。在每块胶上有一已知标准血清,结果为标本血清值与标准值的比较。2多肿瘤标志物蛋白芯片监测系统检测AFP和CA199实验分为9组,与实验第一部分相同。各组均采集空腹静脉血3ml,离心,分离血清,操作过程严格按试剂盒说明书进行。3巢式逆转录多聚酶链反应(nested PCR)法检测GP73 mRNA的表达实验分为5组,乙肝相关性肝细胞癌组、慢性乙型肝炎组和健康人对照组各31例,乙肝相关性肝硬化组20例,另外胆管细胞型肝癌13例。根据Genbank人类GP73 cDNA序列,应用引物设计软件Primer5设计引物。从五组各实验对象抽取外周静脉血0.5m1,立即离心后提取血清,进行RNA提取,定量后以其为模板逆转录合成cDNA链,然后用引物进行PCR扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测,GP73 mRNA的表达量通过与内对照光密度的比较来判断。使用凝胶影像系统和Quantity One分析。结果1血清GP73蛋白能在各组中检测得到,在乙肝相关性肝癌中表现最高。胃癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌血清中的GP73蛋白和健康人比较略有升高但无统计学意义。2测得肝细胞癌患者组GP73蛋白为20.50±12.13相对单位。肝细胞癌GP73的AUROC是0.79(95%CI：0.66-0.92),其敏感度为77.4%,特异度为80.0%,它的最佳截断值为8.3相对单位。而肝细胞癌AFP的AUROC为0.64(95%CI：0.48-0.79),敏感度为61.3%,特异度为75.0%,最佳截断值是20.97μg／L。在肝细胞癌中ROC曲线下面积、敏感度和特异度GP73蛋白要优于AFP。3测得胆管细胞型肝癌血清GP73蛋白为14.22±9.92相对单位,AUROC为0.67(95%CI：0.47-0.87),敏感度为61.5%,特异度为85.0%,最佳截断值为9.1相对单位。胆管细胞型肝癌CA199的AUROC是0.38(CI：0.15-0.60),敏感度为23.1%,特异度为95.0%,最佳截断值是364.82U／ml。胆管细胞型肝癌ROC曲线下面积、敏感度GP73蛋白要优于CA199。血清GP73联合CA199诊断胆管细胞型肝癌的敏感度为70.4%,特异度为80.8%。4肝细胞癌和胆管细胞型肝癌共同组成原发性肝癌,其血清GP73为18.65±11.77相对单位、AFP为99.55±139.51 ng/ml。本研究中胆管细胞型肝癌AFP与正常对照组无差异；而胆管细胞型肝癌血清GP73要明显高于正常对照组,而在其他肿瘤中血清GP73也未见明显升高。5对各肝脏疾病组血清使用nested PCR进行GP73 mRNA定性检测,能检测得到GP73 mRNA。肝细胞癌组在各组中表达最高,其GP73 mRNA的表达率为93.5%(29／31),但正常人的表达率有45.2%。结论1 GP73蛋白在患肝脏疾病中国人中能检测得到,在乙肝相关性肝癌中表达最高,在胃癌,结肠癌,乳腺癌和胰腺癌中GP73不升高。2肝细胞癌血清GP73蛋白通过ROC曲线与AFP比较,血清GP73敏感度和特异度及曲线下面积要优于AFP。因此血清GP73蛋白有可能作为代替AFP的肝细胞癌的血清肿瘤标志物。3胆管细胞型肝癌血清GP73蛋白通过ROC曲线与CA199比较,血清GP73敏感度曲线下面积要优于CA199。因此血清GP73蛋白是优于CA199诊断胆管细胞型肝癌的血清肿瘤标志物。血清GP73联合CA199诊断胆管细胞型肝癌敏感度会进一步提高。4胆管细胞型肝癌血清GP73较正常人明显升高,但血清AFP与正常人比较无差异,因此原发性肝癌血清GP73蛋白可能作为代替AFP的原发性肝癌的血清肿瘤标志物。5 GP73 mRNA能在患肝脏疾病的中国人血清中检测得到,在乙肝相关性肝细胞癌表达率最高,在正常人的表达率为45.2%,提示巢式PCR法检测GP73 mRNA对诊断原发性肝癌无价值。