第一部分CDK1 siRNA干扰对细胞周期和细胞凋亡的影响目的：研究CDK1 siRNA干扰抑制CDK1的表达及其对细胞周期和凋亡的影响。材料和方法：以人宫颈癌细胞株Hela细胞和人结肠癌细胞株SW480细胞为研究对象，脂质体转染CDK1 siRNA，分别用realtime-PCR、westernblot检测CDK1基因和蛋白的表达，AnnexinV／PI法检测转染细胞的凋亡，流式细胞术分析细胞周期阻滞，细胞进行瑞氏-姬姆萨染色后镜下观察其形态学变化结果：转染CDK1 siRNA后CDK1基因和蛋白的表达都下降。转染后24小时，CDK1蛋白表达已经下降，到转染后48小时、60小时，CDK1基因与蛋白都明显降低。转染CDK1 siRNA 48和60小时后的细胞周期G2／M期比例明显增加，而细胞凋亡率与对照相比没有明显升高。转染细胞经瑞氏-姬姆萨染色后，显微镜下看到双核细胞增多。结论：CDK1 siRNA干扰导致的CDK1表达降低只引起细胞周期G2／M期阻滞，细胞增殖减慢，没有导致细胞凋亡。第二部分CDK1 siRNA干扰在Taxol诱导细胞凋亡中的作用目的研究转染CDK1 siRNA在Taxol诱导细胞凋亡过程中的对细胞周期和凋亡的影响，探讨CDK1在细胞凋亡中的确切作用方法以人宫颈癌细胞株Hela细胞和人结肠癌细胞株SW480细胞为研究对象，脂质体转染CDK1 siRNA，转染后48小时加Taxol(20g／ml)刺激，实验设空白对照(未处理)、阴性对照(转染阴性siRNA)、空白对照加Taxol、阴性对照加Taxol、转染CDK1 siRNA、转染CDK1 siRNA加Taxol实验组。加药12小时后收集细胞，用AnnexinV／PI方法检测细胞的凋亡；流式细胞仪检测细胞DNA含量，分析细胞周期的变化；westernblot检测CDK1、BCL2蛋白的表达。结果CDK1蛋白表达水平在转染siRNA组都有明显降低。Taxol(20ug／ml)刺激12小时细胞出现明显G2／M期和S期阻滞以及细胞凋亡。细胞转染CDK1 siRNA后再用Taxol刺激，G2／M、S期阻滞效应和细胞的凋亡反应都没有明显改变。抗凋亡蛋白BCL2也只在加Taxol刺激组表达下降。结论siRNA干扰导致的CDK1表达降低对紫杉醇Taxol所诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡作用没有影响。第三部分共转染CDK1、CDK2 siRNA对细胞周期和细胞凋亡的影响目的研究共转染CDK1、CDK2 siRNA同时抑制CDK1、CDK2蛋白表达对细胞周期和凋亡的影响，探讨细胞周期主要调控分子在细胞凋亡中的确切作用。方法以人宫颈癌细胞株Hela细胞和人结肠癌细胞株SW480细胞为研究对象，用脂质体lipofactamihe2000同时转染CDK1和CDK2 siRNA。在转染后48、60小时收集细胞，用westernblot检测CDK1、CDK2蛋白的表达和抗凋亡蛋白Bcl2的表达，AnnexinV／PI检测转染细胞的凋亡，流式细胞术DNA含量检测分析细胞周期阻滞。AnnexinV／PI标记的细胞同时在激光共聚焦显微镜下观察凋亡细胞的形态；另外转染细胞进行瑞氏-姬姆萨染色后在普通光学显微镜下观察其形态变化。结果共转染CDK1、CDK2siRNA后48小时和60小时，WesternBlot结果显示CDK1和CDK2蛋白的表达都同时降低。共转染CDK1、CDK2 siRNA后，细胞周期在S期和G2／M期都出现阻滞，转染细胞经瑞氏-姬姆萨染色后在显微镜下可见双核或多核细胞增多；AnnexinV结果显示共转染CDK1、CDK2 siRNA的细胞在48小时和60小时都发生了明显的凋亡，激光共聚焦显微镜下的形态学观察也可见到早期凋亡和晚期凋亡的细胞，但westernblot结果显示凋亡蛋白Bcl2的含量没有明显改变。结论siRNA干扰导致的CDK1、CDK2表达同时降低不仅导致细胞周期S期和G2／M期的阻滞，抑制了细胞生长，也诱导了细胞凋亡。也间接说明CDK2可以替代CDK1的部分功能。