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慢性锰中毒产生的功能性损伤与自发性PD锥体外系的表征和症状紧密相关，其主要病理进程是选择性的黑质纹状体多巴胺能细胞的退行性变性，导致纹状体多巴胺的耗竭。体内和体外实验揭示锰可能是一种多巴胺能的神经毒素，与帕金森氏病这类神经退行性疾病的发生有关。多项研究表明凋亡在锰及MPP~+引起的多巴胺能神经毒性作用中起着重要作用。 丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)在将细胞外刺激信号转导至细胞及核内的过程中，通过丝／苏／酪氨酸磷酸化，参与细胞增殖、分化及凋亡等及其重要的生物学反应。胞外信号调节激酶(ERK)信号转导主要参与细胞增殖与分化的调控。p38MAPK多在应激条件下激活，可能与细胞凋亡及应激时的多种病理生理过程有关，而且并行的MAPK信号通路相互协调、相互调控。 近年来，锰与细胞增殖、凋亡关系的研究受到了关注，有学者试图证明细胞凋亡在锰中毒机制中的贡献。初步的研究结果认为较低剂量的锰(0.03mM)短时间作用于神经细胞其磷酸化水平明显增高，但也有降低的报道，同时锰引发了p-p38表达的升高，并且有细胞发生凋亡的证据， 第四军巴大学硕士学攸蛤X24h和 48h的细胞生存活力实验表明锰可使细胞增殖抑制I‘q。由于实验条件不同，研究结果不一致。一般认为锰作为机体必需微量元素和多种酶的活性或激活因子，低浓度锰短时间作用可诱导ERK ffiRKZ的磷酸化增高，PC12细胞的增殖、分化需要ERKlffiRKZ的磷酸化。而高剂量较长时间的作用则会表现为毒性作用。 基于以往的实验事实，我们以多巴胺能的鼠嗜铬神经瘤细胞PC12为模型，筛选锰对神经细胞增殖抑制作用的时间及剂量效应关系，探讨在此过程中细胞MAJ，KS信号转导通路活化表达的特点及其相互之间的关系，旨在寻找锰等PD相关环境危险因子对基底神经节损伤作用的分子机制，以期揭示PD等神经退行性疾病的病因学基础，为制定环境危险因子的暴露剂量、临床治疗神经退行性疾病奠定基础。实验方法 取对数生长期神经细胞株PC，使用含有200、400、600、800pthol几MflC12的培养液，分别作用 l，2，3，4天后，用噬哇蓝（MTT）比色试验和平板集落形成实验检测细胞的存活和生长；台盼蓝染色法绘制细胞生长曲线；筛选锰的细胞毒性剂量；流式细胞仪检测细胞周期分布；透射电镜观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳检测 MnCI。对 PC细胞基因组 DNA的影响。western七lot法检测 ERKI厘和 p38蛋白磷酸化水平实验结果 MTT和平板克隆形成实验检测结果显示200｛00pmol／L MnCI。作用1、2、3、4天均对 PC细胞株有显著的抑制作用，且呈剂量和时间依赖效应关系而且600卜mol／L MnClz作用 4天对PC12的抑制率可达50％以上。流式细胞仪检测结果表明：600pmol／L MnCI。作用4大可将PC12细胞生长周期阻滞在S期，并且诱导细胞凋亡，与电镜结果表现一致，同样条件下 PC细胞出现了 DNA碎片化，这是凋亡的生化特征。Western七lot结果显示 600pmol几 MnC12作用 1，2，3，4天可见 EIUCZ磷酸化水平呈逐渐降低趋势，其中作用2天时较对照明降低了75％…－3，P＜0刀5X －3－ 第回旱巨大学项士学位论文一200，400，600pmol几 MnClz分别作用4天时，ERKZ磷酸化水平亦逐渐降低，当400卜＜of几MnO2作用4天时较对照明降低了78Wn一，p＜0刀1卜使用ERK通路MEKI／2特异性阻制剂PD98059实验结果表明：锰是通过MEKI0磷酸化下游的ERKI／2，下调ERKI／2的磷酸化水平。600pmol／LMnC12作用1，2，3，4天可见p38磷酸化水平逐渐升高，其中作用3天时较对照组增加 6石倍（n＝3，p＜0刀5），200，400，600pmow MnCI。分别作用 4天时，p38磷酸化水平也是逐渐升高的，当 400pmoMi MnCI。作用 4天时较对照组升高了4、7倍（n＝3 3p仍刀5卜使用p38通路的特异性阻断剂SB203580实验结果表明锰是通过MEK3历磷酸化下游的p38，上调p38的磷酸化，诱导细胞凋亡。实验表明细胞内信号转导通路激活作用先于形态学改变，ERK磷酸化水平的降低和p38磷酸化水平的增高共同作用导致细胞增殖抑制引发凋亡，并且呈剂量和时间依赖效应。结论 锰对 PC细胞增殖具有显著的抑制作用，诱导凋亡可能是锰的神经毒作用机理之一。凋亡的分子机制可能是通过MAPKS信号转导通路的协调反应实现的。随着锰作用浓度的增高、作用时间的延长，PC细胞MAPKS信号转导通路中 EIUCZ的磷酸化逐渐丧失、p3 8活化表达水平逐渐升高，实验表明细胞内信号转导通路激活作用先于形态学改变，ERKZ磷酸化降低和 p3 8磷酸化增高共同作用导致细胞增殖抑制引发凋亡，并且呈剂量和时间依赖效应。 由于MAPKS信号通路是个庞大的网络系统，我们有必要进一步对锰作用下ERKo及p38上游和下游的信号分子做更为深入的研究工作。