实验目的:结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤之一,2020年全球癌症统计结果显示,中国结直肠癌的发病和死亡比例分别占12.2%和9.5%。此外,由于现代社会中越来越多的年轻人因不健康的生活和饮食方式等因素,导致结直肠癌的发病趋于年轻化。当前结直肠癌大多数病例的医治方法仍是手术和化疗,虽然这些方法在临床治疗中有一定的疗效,但是其治疗费用高昂、术后复发率高、副作用大、肝肾等相关功能受到损伤以及引起并发症等弊端也成为治疗结直肠癌的主要问题,靶向治疗与上述手段相比,虽然其毒副作用较小,针对性较高,但也因耐药性大大的限制了临床应用,因此急需开发廉价、高效、低毒的新型治疗药物。己酮可可碱（PTX）是一种从可可豆中提取得到的黄嘌呤化合物,已用于治疗脑部血循环障碍、外周血管病、突发性耳聋、间歇性跛行等疾病,最近还被证明具有抗癌活性,能抑制乳腺癌、黑色素瘤等多种癌细胞增殖,但其在结直肠癌中的作用机制还未完全明确。因此本实验利用结直肠癌SW620细胞,研究PTX诱导其凋亡机制,由此为PTX在治疗结直肠癌方面提供新的理论,其可能作为治疗结直肠癌的潜在先导化合物。实验方法:使用不同浓度的PTX处理SW620细胞,检测内容如下:1.使用倒置显微镜观察SW620细胞的形态;利用MTT法检测PTX对细胞增殖的作用。2.通过Annexin V-FITC/PI双染色法、PI单染色法和DCFH-DA探针法处理SW620细胞,利用流式细胞术检测药物对其凋亡程度、周期分布和细胞内活性氧（ROS）水平变化的作用;DAPI染色后利用荧光显微镜观察PTX对SW620细胞的影响。3.利用免疫印迹法（western blot,WB）检测凋亡、周期、自噬和AKT/GSK-3β通路相关蛋白表达,包括Cleaved-PARP、Cyclin D1、p21、LC3B、Beclin-1、AKT、p-AKT、GSK-3β和p-GSK-3β。4.将SW620细胞分别经ROS清除剂NAC和自噬抑制剂3-MA预先处理后,通过MTT法和WB法检测药物刺激产生的细胞内ROS对细胞增殖、细胞自噬及AKT/GSK-3β信号通路产生的影响。结果:1.通过MTT法证明PTX能抑制人结直肠癌细胞的增殖,其抑制程度呈现浓度依赖性,并且经显微镜观察,随着PTX浓度的增加,SW620细胞的形态发生明显变化。2.通过流式细胞术显示,经PTX作用后SW620细胞周期多分布在G0/G1期,且呈现浓度依赖性。WB实验显示在SW620细胞中PTX能上调p21以及下调Cyclin D1蛋白。3.流式细胞术结果证明,PTX能使SW620细胞发生凋亡,随着PTX浓度的增加,DAPI染色观察到蓝色荧光变得强烈且数目增加。4.流式细胞术结果证明,PTX能增加细胞内ROS水平并且呈现浓度依赖。此外,MTT实验结果显示,NAC预处理后能恢复SW620细胞活力,减弱PTX对SW620细胞增殖的抑制作用。5.WB实验结果显示,PTX可上调Cleaved-PARP、抑制AKT和GSK-3β磷酸化,由此影响AKT/GSK-3β通路,而加入NAC处理后,p-AKT和p-GSK-3β表达量增加,AKT和GSK-3β没有明显的变化。6.通过WB实验检测自噬相关蛋白,结果显示随着PTX药物浓度的增加,LC3B-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达量均呈上调趋势,而经NAC预处理后,两者的表达量均降低。MTT实验结果显示,在SW620细胞中3-MA预处理后可减弱PTX对其增殖的影响。结论:根据以上实验结果可以证明,PTX能抑制SW620细胞增殖,诱导细胞凋亡。第一,PTX通过降低Cyclin D1蛋白的表达水平和上调p21的表达,将细胞周期阻遏在G0/G1期,以抑制SW620细胞增殖。第二,PTX能诱导胞内ROS增加,通过ROS介导下调p-AKT和p-GSK-3β表达,抑制AKT/GSK-3β通路,并且通过ROS上调LC3B-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,激活凋亡性自噬的发生,最终促进SW620细胞凋亡。综上,PTX不仅具有已用于临床治疗的改善脑循环,消炎等作用,还可以作为一种潜在的先导化合物,为结直肠癌的治疗提供一个新的策略。