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哺乳动物在生长发育过程中会不断受到外界环境中病原微生物的侵染,从而它们进化出了比较完善的免疫系统来抵制外界病原体的侵染。免疫系统可分为固有免疫系统和获得性免疫系统,固有免疫系统是机体抵抗外来致病因子入侵的第一道防线,主要是通过模式识别受体(PRRs)识别高度保守的病原相关分子模式(PAMPs),然后再经过细胞中的一系列信号级联反应激活免疫应答的发生。最近的研究显示,作为模式识别受体NOD样受体(NLRs)蛋白家族中最具有代表性的NOD1和NOD2,可以通过识别特异性配体二氨基庚二酸(iE-DAP)和胞壁酰二肽(MDP)而迅速启动固有免疫反应,并能通过激活NF-κB和MAPK等信号传导途径,在机体免疫防御细菌感染中发挥作用;也有报道显示它们可以识别和抵抗病毒感染,虽然具体机制尚不清楚。在畜牧业发展的今天,猪作为一种重要的模式动物,同时也是重要的经济动物,猪的健康与人类的生活需求一脉相连。因此,本研究从猪源细胞中克隆出NOD1和NOD2两种受体编码基因并构建真核表达质粒来鉴定两种受体蛋白表达和信号功能;另外,通过构建NOD1和NOD2基因敲除细胞系进一步鉴定它们在抗病原微生物感染中所发挥的重要作用;最后还通过构建NOD1原核表达质粒进行蛋白纯化和单克隆抗体制备,这为后期进一步研究提供良好的生物材料。具体研究内容分为以下三个部分:1猪源NOD1(pNOD1)、NOD2(pNOD2)基因克隆表达及信号功能鉴定分别从猪的PAM和PK15细胞中RT-PCR扩增出pNOD1和pNOD2两个受体编码基因的全长cDNA序列,pNOD1为2867bp,pNOD2为3039bp。利用Gateway LR克隆技术成功构建了 C-端分别携带2HA和3FLAG标签的真核表达质粒pcDNA-pNOD1和pcDNA-pNOD2。Western blotting检测pNOD1和pNOD2的蛋白表达水平,蛋白大小都约为125kDa,pNOD1的蛋白表达水平较高,而pNOD2蛋白的表达水平较低。对pNOD1和pNOD2信号功能进行鉴定:将真核表达质粒与ELAM(NF-κB)启动子虫萤光素酶报告基因、肌动蛋白启动子海肾荧光素报告基因共转染HEK293T细胞,分别用特异性配体iE-DAP和MDP的刺激,双荧光素酶报告系统检测结果显示,pNOD1具有较强的组成性活性,pNOD1和pNOD2都可以识别相应特异性配体介导下游NF-κB信号活化。同时定量RT-PCR检测pNOD1和pNOD2转染HEK293T细胞下游基因表达,结果表明下游细胞因子IL-8的转录水平明显上升,与下游NF-κB信号活化一致。运用启动子报告基因试验分析pNOD1和pNOD2信号功能关系,没有发现明显的相互抑制或者促进作用。另外,将pNOD2转染NF-κB双荧光素酶信号HEK293报告细胞,用G418筛选获得pNOD2-NF-κB双荧光素酶信号稳定报告细胞。成功构建的pNOD2-NF-κB双荧光素酶稳定报告系为以后的筛选工作提供了有效工具。2 pNOD1和pNOD2抗病原微生物作用鉴定利用CRISPR-cas9技术,分别设计pNOD1和pNOD2基因对应的gRNAs,将gRNAs与慢病毒载体pLentiCRISPRv2连接,对测序正确的gRNAs病毒重组载体进行功能鉴定。将pNOD1和pNOD2表达质粒和对应的gRNAs载体共转染HEK293T细胞,Western blotting检测分析鉴定gRNAs有效性和特异性。将鉴定的gRNAs质粒进行慢病毒包装,病毒上清液分别感染PAM、PK15和IPEC-J2细胞,经过嘌呤霉素的筛选,获得最终存活的基因敲除(KO)稳定细胞系。将构建好的pNOD1、pNOD2KO和载体对照稳定细胞系用于感染鼠伤寒沙门氏菌(PAM)、猪大肠杆菌(PK15)、猪和人流感病毒(PAM)、猪流行性腹泻病毒(IPEC-J2),细菌计数和qRT-PCR结果显示与对照相比,pNOD1 KO和pNOD2 KO细胞系感染以上病原微生物时,细菌增殖以及病毒复制水平都显著上升;其中pNOD1 KO和pNOD2 KO细胞系在感染鼠伤寒沙门氏菌和流感病毒后下游基因主要是抗病毒蛋白基因的转录水平明显下降。这说明pNOD1和pNOD2在宿主受到病原侵染时发挥防御作用的重要性。3重组pNOD1原核蛋白表达及单克隆抗体的制备Gateway LR克隆技术构建原核表达质粒pDest527-pNOD1,并将其转化至大肠埃希菌DE3/BL21,Western-blotting检测到目的蛋白的正确表达,目的重组蛋白主要在沉淀中表达。选择优化表达条件大量培养重组菌并诱导表达蛋白,从细菌沉淀中纯化包涵体,包涵体蛋白用8M尿素变性再用浓度梯度6M、4M、2M、0M尿素依次复性最终得到可溶性蛋白。将目得pNOD1纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度为1:10000-1:50000。将免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,通过对杂交瘤细胞上清液的多次ELISA检测,并进行三次亚克隆,最终获得一株稳定分泌抗体的阳性细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体可以Western blotting检测外源性和内源性pNOD1的蛋白表达,为后期研究蛋白功能提供了生物材料。