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由猪胞内劳森菌（Lawsonia Intracellularis,L.intracellularis）所引起的猪增生性肠炎（Porcine proliferative enteritis,PPE）给国内外养猪业带来了巨大的损失。替米考星因其对胞内劳森菌具有较强的抗菌活性和优异的细胞膜渗透性,已作为临床治疗猪增生性肠炎的重要药物之一。为了科学规范替米考星在猪增生性肠炎治疗上的应用并避免其耐药性的产生,利用药动学-药效学（Pharmacokinetic-Pharmacodynamic,PK-PD）同步模型制定替米考星对猪胞内劳森菌的合理给药方案尤为重要,同时也为胞内菌PK-PD同步模型的研究提供参考。本课题拟在建立胞内劳森菌分离培养鉴定体系的基础上,利用PK-PD同步模型制定出前期研发出的适口性好、作用时间长的替米考星混悬剂对猪胞内劳森菌的合理给药方案,以期在取得最佳疗效的同时,又避免细菌耐药性的产生,为有效防控猪胞内劳森菌提供了新的治疗方案,充分发挥替米考星混悬剂的临床应用价值和促进养殖业健康发展具有重要意义。1 猪胞内劳森菌的分离、培养和鉴定体系的建立利用猪胞内劳森菌活疫苗作为模式菌株,建立聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）、实时荧光定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction,Real-time PCR）和过氧化物酶细胞单层染色法（Immunoperoxidase Monolayer Assay,IPMA）等三种猪胞内劳森菌的鉴定和检测方法;通过对样品中细菌数量、消化孵育时间和滤膜孔径等方面优化分离体系;通过对感染剂量和感染时间等方面优化培养体系,并从仔猪回肠末端分离猪胞内劳森菌。结果显示,所建立的三种猪胞内劳森菌检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。细菌分离培养时,当感染剂量为5×105L.intracellularis/m L,感染时间为3 h时具有最佳的感染效率。猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞（Intestinal porcine epithelial cell,IPEC-J2）中的生长曲线显示:猪胞内劳森菌在第0-1 d、第2-5 d、第6 d和第7-8 d分别处于迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。回肠中的猪胞内劳森菌数量越多、消化孵育的时间为30 min以及滤膜孔径依次为5、1.2和0.65μm时,分离成功率更高。PCR扩增分离临床菌株的大小为319bp目的条带,根据实时荧光定量PCR扩增出的动力学曲线计算出所分离菌株浓度为5×105L.intracellularis/m L,IPMA将IPEC-J2细胞中劳森菌染色为红色荧光,上述三种鉴定方法均表明所分离菌株为猪胞内劳森菌。2 替米考星对猪胞内劳森菌的抗菌作用研究对猪胞内劳森菌的临床分离株进行抗菌作用研究,分别测定替米考星对猪胞内劳森菌胞内和胞外最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration,MIC）、体外和半体内胞内杀菌曲线、防突变浓度（Mutant Prevention Concentration,MPC）以及抗菌后效应（Post-antibiotic effect,PAE）。通过四甲基偶氮唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测替米考星对IPEC-J2细胞活力的影响,结果表明,64μg/m L的替米考星与IPEC-J2细胞培养3 d时,细胞存活率降至79.5%;32μg/m L替米考星与IPEC-J2细胞培养4 d时,细胞存活率降到79.1%。替米考星对猪胞内劳森菌的胞内MIC、胞外MIC和MPC分别为2、4和6.4μg/m L,故耐药突变选择窗（Mutant selection window,MSW）范围为2-6.4μg/m L。替米考星与胞内劳森菌共同孵育1 h和2 h的PAE分别为0.82-5.03 h和2.53-6.92 h。体外和半体内胞内杀菌曲线呈现显著的浓度依赖性。因此,最终选择药时曲线下面积与最小抑菌浓度的比值（Area under the concentration-time by MIC,AUC/MIC）作为PK-PD拟合参数。3 替米考星预混剂和混悬剂在猪血浆和回肠中的药动学研究试验选取24头体重22 kg左右的健康断奶三元杂交仔猪,随机分为4组,每组6 头。在回肠段安装T型瘘管,建立仔猪回肠瘘管模型。采用胞内劳森菌临床分离株建立人工感染的仔猪增生性肠炎模型。感染组和健康组仔猪均按10 mg/kg的剂量分别被灌服替米考星预混剂和混悬剂,分别于给药后0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24和48 h采集血液和回肠内容物,用高效液相色谱方法（High performance liquid chromatography,HPLC）分别测定血浆和回肠内容物中游离的替米考星浓度,使用Winnonlin软件中的非房室模型对数据进行模拟。结果表明,替米考星预混剂和混悬剂在健康和患病仔猪血浆和回肠内容物中的达峰时间(Peak time,Tmax)均为2 h。替米考星预混剂在健康和患病仔猪血浆中的达峰浓度(Peak concentration,Cmax)、药时曲线下面积(Area under the concentration-time curve from time 0 to 24 h,AUC0-24h)分别为1.08±0.04和0.99±0.03μg/m L、9.61±1.47和9.30±1.43 h·μg/m L。在健康和患病回肠内容物中的Cmax、AUC0-24h分别为3.78±0.03和3.41±0.06μg/m L、20.41±1.64和22.65±1.32 h·μg/m L。替米考星混悬剂在健康和患病仔猪血浆中的Cmax、AUC0-24h分别为1.23±0.02和1.16±0.13μg/m L、14.39±0.35和14.84±0.42h·μg/m L。在健康和患病仔猪回肠内容物中的Cmax、AUC0-24h分别为4.57±0.37和3.68±0.43μg/m L、25.81±0.24和24.54±0.34 h·μg/m L。4半体内PK-PD模型拟合和给药方案制定利用Sigmoid Emax模型对半体内胞内杀菌曲线试验中AUC0-24h/MIC值与猪胞内劳森菌浓度变化对数值之间的关系进行拟合,计算当E=0、-3和-4时所需的PK-PD参数(AUC0-24h/MIC)值。结合MIC值、CL/F和AUC0-24h/MIC值等,利用蒙特卡罗模拟预测预防、治疗和根除效应的日给药剂量,并对给药方案进行预测。当E分别取0、-3和-4时计算得到对应的抑菌、杀菌和根除作用的AUC0-24h/MIC值分别为6.87、26.80和36.02 h（替米考星预混剂）,5.77、23.32和36.18 h（替米考星混悬剂）。根据剂量计算公式,结合蒙特卡罗模拟得到替米考星预混剂临床预防、治疗和根除猪增生性肠炎的日给药剂量分别为2.95、14.39和15.48 mg/kg,替米考星混悬剂为2.48、12.53和15.54 mg/kg。基于细菌生长动力学机制的PK-PD模型预测,结果表明,治疗和根除剂量以24 h给药间隔连续给药3次均能取得预期的治疗和根除效果,而预防效应的推荐给药方案为24 h给药一次。为方便规模化猪场群体给药,替米考星预混剂日给药剂量转换为饲料中添加的剂量分别为60、280和300 mg/kg,替米考星混悬剂日给药剂量转换为饮水中添加的剂量分别为25、125和150 mg/L。本课题建立了胞内劳森菌的分离、培养和鉴定体系,利用仔猪回肠内容物建立了替米考星预混剂和混悬剂对猪胞内劳森菌的半体内PK-PD模型,制定出替米考星预混剂和混悬剂治疗、预防和根除猪增生性肠炎的科学合理给药方案,并对给药方案进行了预测,可有效控制猪增生性肠炎,为新兽药注册提供了相应的临床试验资料。同时,本研究为其他胞内菌PK-PD同步模型的研究提供参考。