研究背景与目的:以往对终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)患者免疫失调大多数研究都集中在T淋巴细胞免疫,这里我们研究了终末期肾病患者B淋巴细胞重链的组成和变化。免疫组库(immune repertoire,IR)是指在任何指定时间,某个个体的循环系统中所有功能多样性B淋巴细胞和T淋巴细胞的总和。B细胞抗原受体((B cell receptor,BCR)是B细胞识别抗原的一种膜表面免疫球蛋白(SmIg),具有抗原结合特异性。BCR由两条重链和两条轻链连接而成,其中重链分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区及胞质区;而轻链则只有V区和C区。V区由VH和VL两个结构域组成,它们各由三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)组成,CDR的氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性,在同一个体内,可高达109～1012,构成容量巨大的BCR库,赋予个体识别各种抗原、产生特异性抗体的巨大潜能,这三个CDR均参与对抗原的识别,共同决定BCR的抗原特异性。免疫组库拥有6种主要的肽链,分别为BCR的轻链和重链、TCR的a、β、γ和δ链。免疫组库中每一种免疫蛋白彼此间结构差异很小,但亚型种类繁多,正是这种多样性对健康起着至关重要的作用,免疫蛋白的亚型越多,越能有效抵抗病原体,亚型越少越容易感染疾病。除此之外,其它很多年龄、环境、疾病诱发以及用药等因素也影响着免疫组库的多样性。由于CDR3区是淋巴细胞识别抗原的主要部位,其长度及多样性都会影响它对抗原的识别与亲和力,故其特异性可以认为是基因重组和体细胞高频突变的结果,CDR3序列多变的特征为抗原的选择提供一个多样化的细胞受体库。通过分析CDR3受体库,能为临床更好地监测和分析生理及病理状态下机体的免疫状况及免疫细胞的发生、发展机制提供新思路、新方法和手段,因此本研究中只对ESRD患者B淋巴细胞BCR的重链CDR3进行研究。新一代高通量测序(next generation sequencing,NGS),是一种大规模测序技术,一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,可对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析。NGS为现代生命科学以及医学领域的研究提供了前所未有的机遇,在此基础上与临床疾病诊断、预后评估以及基因靶向治疗相结合,可提高临床诊断和治疗、方便监测疾病进展。之前的一些研究[1-7]表明在患ERDS的成人和儿童中检测出B淋巴细胞显著减少。此外,已经被证实在患有慢性肾衰竭的儿童中,CD5+固有B细胞和CD27+记忆B细胞明显减少。在一项最新研究中,也[1]证实了在患有ESRD的成人中有另外几种B细胞亚型显著减少本。材料与方法:1.研究对象病例来自于桂林解放军第181医院器官移植中心住院的ESRD患者,所有患者均符合美国肾脏病基金会K/DOQI专家组对ESRD患者诊断标准。ESRD患者诊断标准:].肾小球滤过率(GFR)《15ml/min并大多数患者伴有尿毒症症状2.需要开始肾脏替代治疗(透析或肾移植)ESRD患者10例，女3例,男7例,年龄25-63岁,平均年龄35.64±11.27岁,病程0.2-8年。健康对照6例，女3例,男3例,年龄为24-47岁,平均年龄33.47±9.61岁,为同一医院同一时间段的健康体检者,不符合ESRD诊断标准,无重大疾病史,本人或直系亲属无ESRD病史。2.研究方法我们对10名肾移植术前ESRD患者为实验组和6名同时间段内正常体检者为对照组新抽取外周血,用淋巴细胞分离液分离外周血T/B淋巴细胞,提取DNA,采用多重PCR/5’RACE对CDR3进行捕获,通过Illumina MiSeq平台进行高通量测序。测序得到的原始测序序列(Sequenced Reads)或者Raw Reads(RR),为了保证信息分析质量,必须对RR过滤,得到待分析数据(clean reads,CA),将CA与IMGT免疫细胞受体库的V\D\J基因比对,搜索相应的基因片段,为确保结果的高准确度,在完成初步比对后,将比对序列再次与数据库做重比对,以寻找精确的V\D\J基因片段和序列的位点。统计分析VDJ基因频率,克隆频率分布,多肽序列数目等信息,从而构建免疫组库。本研究以ESRD患者B淋巴细胞为研究目标,以多重PCR或5’RACE技术目的扩增决定B细胞受体(BCR)多样性的互补决定区(CDR区),再结合高通量测序技术,全面评估免疫系统的多样性,深入挖掘免疫组库与疾病的关系。结果和结论:在这项研究中,对10例肾移植术前终末期肾病(ESRD)患者和6名同时间段内正常体检者BCR重链(IGH)利用NGS测序,我们对比CDR3,V,D,J和V-J的分布,以及对香农熵(Shannon entropy,SE)、高克隆(Highly enpended clone,HEC)的计算,与正常对照组相比,ESRD患者的B淋巴细胞克隆性扩增程度增加,B淋巴细胞免疫组库多样性较低,免疫组库测序可以从DNA序列,AA序列和V-J组合水平分析RSRD患者免疫组库的多样性,以开发生物标志物早期诊断疾病。成熟B细胞从外周血迁出到脾脏、淋巴结,主要在脾小结,脾索及淋巴小结和胃肠道黏膜。与抗原的刺激,B淋巴细胞增殖分化成浆细胞,然后分泌抗体发挥体液免疫功能。BCR的CDR3区域不同的分子结构代表的不同的B淋巴细胞群体。本研究中,我们用新一代测序技术研究ESRD患者外周血单个核细胞的BCR H链CDR3基因的多态性和特征谱。绝大部分B细胞的克隆(Clones)在BCR序列中的频率较低,表明这些克隆没有克隆性扩增。而在本研究中每个个体的BCR H链CDR3图谱中都发现一些高克隆(Highly enpended clone,HEC),可能是机体在环境中的抗原或病原体的刺激下形成的。我们发现ESRD患者组和NC组的克隆都有克隆性扩增的现象,ESRD患者组的克隆性扩增程度要高于NC组。ESRD是多因素的、遗传素质、性激素和环境因素等相互作用引起疾病,而且ESRD患者在体内毒素聚集后又会影响患者免疫状态。在B淋巴细胞发育过程中,BCR的V、D、J基因片段发生重排,在V-J片段间或在V-D-J片段间可随机插入不同数量的核苷酸,也可在V-J片段间或在V-D-J片段间可随机缺失不同数量的核苷酸,形成具有高度多样性的可变区CDR3,其在长度和氨基酸序列上存在较大差异,即CDR3序列决定了一个独特的BCR克隆型,因此可通过检测CDR3的长度来判断B淋巴细胞的克隆性。然而,本研究中,我们对ESRD患者组和NC组的CDR3长度分布正态性做了比较,可以看出ESRD患者组长度分布特征更趋向于偏态分布,而NC组则趋向于正态分布,没有显著性统计学差异。我们对ESRD患者组和NC组每个样本的香农熵和HEC做了比对,从数量和比例来看,有两组的差异。但由于样本量较小的,统计学意义并不显著。我们还系统地分析了V,D,J和V-J段的使用频率,我们抽取6名正常的志愿者和10名ESRD患者外周血单个核细胞,通过BCR H链的V,D,J和V-J段的使用频率的T检验,我们找到上调基因:IGHVI-24,V-J组合(IGHV3-9,IGHJ1),V-J组合(IGHV1-46,IGHJ3),V-J组合(IGHV3-48,IGHJ1),V-J组合(IGHV2-I,IGHJ3);下调基因:IGHV3-20,IGHD4/OR14-4a,IGHD4/OR14-4b,IGHJ5,V-J组合(IGHV3-20,IGHJ5),V-J组合(IGHV3-49,IGHJ5),V-J组合(IGHV3-64D,IGHJ3),V-J组合(IGHV3-20,IGHJ4),V-J组合(IGHV1-69,IGHJ1)。这些异常表达的BCRH链CDR3的V,D,J和V-J组合基因亚家族可能参与ESRD疾病的发生发展过程。说明ESRD在多因素的、遗传素质、性激素和环境因素等相互作用引起疾病过程中以及ESRD患者在体内毒素聚集后影响患者免疫状态,在这个过程中,这些上调基因IGHV1-24,VJ组合(IGHV3-9,IGHJ1),VJ组合(IGHV1-46,IGHJ3),VJ组合(IGHV3-48,IGHJ1),VJ组合(IGHV2-I,IGHJ3)可能参与某些BCR特异性的B淋巴细胞克隆性增殖的现象,破坏BCR的多样性。而BCR的多样性对健康起着至关重要的作用,免疫蛋白的亚型越多,越能有效抵抗病原体,亚型越少越容易感染疾病;这些下调基因IGHV3-20,IGHD4/OR14-4a,IGHD4/OR14-4b,IGHJ5,VJ组合(IGHV3-20,IGHJ5),(IGHV3-49,IGHJ5),VJ 组合(IGHV3-64D,IGHJ3),VJ 组合(IGHV3-20,IGHJ4),VJ 组合(IGHV1-69,IGHJ1)可能参与抑制某些BCR特异性的B淋巴细胞克隆性增殖,而使得某些B淋巴细胞亚型显著减少。这也正好与之前一些研究证实的在ESRD患者中B淋巴细胞显著减少所对应。总之,我们成功的应用免疫组库测序方法从序列水平研究整个免疫图谱的多样性。进一步研究应该更好地阐明BCR图谱在免疫识别,自身免疫性和自身反应中的作用。以期更好地理解疾病的致病机理,并对其诊断、治疗和预防提供新的思路。由于我中心为器官移植中心,ESRD患者的治疗有两种,一种为替代治疗,包括血液净化及腹膜透析治疗,另一种为肾移植,为根治方法,我们选取10例肾移植术前ESRD患者为对照组,通过NGS分析并建立免疫组库,并且与同时间段正常人作对比,目的是为了了解肾移植术前患者免疫状态,为患者术后免疫方案的制定调整,术后感染风险的评估等提供依据。