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I型干扰素(Type Ⅰ interferons)是关键的抗病毒细胞因子,在脊椎动物物种形成过程中不断进化以应对各种各样的病毒威胁。α干扰素(Interferon-α,IFN-α)是由机体白细胞对抗病毒、细菌或其他外来入侵者产生的,具有抗病毒增殖、抗肿瘤生长和免疫调节等多种生物学功能的糖蛋白。目前,有关动物干扰素的研究发展迅速,市场已有鸡、犬、猪等商用重组干扰素产品面市。然而,国内外有关于华北豹(Panthera pardus fontanierii)干扰素方面的报道寥寥无几。华北豹是我国特有的豹亚种,又称中国豹(Chinese Leopard)。由于栖息地的破坏、人类的杀戮和病毒性疾病的传播,华北豹的数量呈现急剧下降的趋势,已被列入世界自然保护联盟濒危物种红色名录。干扰素的广谱抗病毒作用很可能成为防治华北豹病毒病的新途径和新方法,也符合当前自然生态、无污染、无残留、绿色环保的标准。根据GenBank发表的金钱豹IFN-α基因序列,我们设计并合成了一对特异性引物。以华北豹的核酸DNA为模板,首次扩增得到11个华北豹IFN-α家族的亚型基因(PfIFN-α/α1/α2/α3/4/α5/α6/α7/α8/α9/α10)。序 列 分 析 表 明:PfIFN-α/α1/α2/α3/4/α5/α6/α7/α8开放阅读框长度为570bp,编码188个氨基酸。PfIFN-α9和PfIFN-α1 0开放阅读框为567bp,编码187个氨基酸。信号肽为23个氨基酸组成的一段疏水性跨膜区结构,成熟肽区域主要为亲水性的无跨膜区蛋白。它们都含有6个保守半胱氨酸残基,位于成熟肽序列的1AA,29AA,69AA,87AA,100AA和138AA。11个PfIFN-αs核苷酸同源性为97.4%-99.8%,氨基酸同源性为93.7%-98.9%。华北豹IFN-α亚型蛋白结构主要由5个α-螺旋(Alphα helix)组成(占比高于60%)。同源性和系统发育树分析表明,华北豹IFN-α亚型基因与哺乳动物尤其是食肉目动物IFN-α基因同源性比较高,遗传距离也相对较近。将PfIFN-αs亚型基因成熟肽序列与原核表达载体pET32a(+)连接,构建重组表达质粒pET32a-PfIFN-αs,转化大肠杆菌TSsettα(DE3)。SDS-PAGE电泳分析表明,表达产物主要以包涵体形式存在,经纯化复性获得大小约为37KDα的重组蛋白。优化其表达条件,重组蛋白在0.8 mM IPTG浓度下诱导表达6小时获得最佳表达量。以纯化的PfIFN-α重组蛋白为免疫原,制备兔抗PfIFN-α多克隆抗体。采用酶联免疫吸附测定检测其抗体效价达到1:204800。经Westernblot证明,兔抗PfIFN-α多克隆抗体可特异性识别PfIFN-αs重组蛋白。综上所述:本研究成功克隆得到11个PfIFN-αs基因,构建其重组原核表达质粒并实现重组蛋白的表达、纯化和复性,为后续PfIFN-αs理化性质和生物学活性研究提供物质依托。