油菜是世界范围内广泛种植的油料作物之一,也是我国食用植物油的重要来源。我国油菜主产区长江流域的菜籽含油量长期徘徊在42%左右,而加拿大和欧洲等各国菜籽的含油量可达45%⁵0%;油菜含油量每提高一个百分点,相当于单位面积产量提高约2.5个百分点。因此,探索甘蓝型油菜产油量提高的途径具有十分重要的意义。本研究通过对含油量性状的QTL和GWAS分析,并结合极端高低含油量材料的转录组分析鉴定含油量相关的候选基因。同时,由于拟南芥中FAX1被报道参与脂肪酸转运,并且有助于提高生物量和种子含油量,为了探索甘蓝型油菜中FAX1是否具有同样的功能,本研究通过对脂质转运相关的膜蛋白BnaFAX家族基因进行分析,最终筛选出含油量主效功能基因BnaFAX1-1和BnaFAX1-2,并通过对其在拟南芥中异源过表达和在甘蓝型油菜中同源过表达植株的表型及功能验证分析,明确了BnaFAX1在油菜油脂累积和生物量提升中的重要作用。本论文的主要研究内容及结果如下:1.重组自交系群体含油量的QTL定位本研究以黄籽油菜GH06为母本（含油量:约44.57%）,以黑籽油菜中油821为父本（含油量:约36.69%）,两亲本杂交F₂代通过“一粒传法”连续自交10代,构建了包含186个株系的高世代重组自交系群体（RIL）,连续三年（2016²018）种植于重庆市北碚区歇马镇油菜种植基地（北纬29o45’39.99",东经106o22’38.47",海拔238.57 m）,该群体采用60K芯片构建了包括8575个SNP标记,1201个簇,覆盖甘蓝型油菜基因组6140.2cM的高密度遗传连锁图谱,其中,用于QTL分析的参考图谱包括5560个SNP位点,标记之间平均距离为1.10cM。利用Win QTL Cartographer 2.5软件,采用复合区间作图法,对三年实验的群体含油量数据进行了QTLs检测,共检测到26个与含油量相关的QTLs,单个QTL解释含油量的表型变异（R²）在3.69%¹8.47%之间,单个QTL的加性效应在-1.57¹.43之间。这些位点主要分布在A01,A03,A05,A06,A09,C01,C03和C05染色体上。其中2016-qOCA09-1和2017-qOCA09-2位置重叠,2016-qOCA09-2和BLUP-qOCA09-1位置重叠,2018-qOCA09-1和BLUP-qOCA09-2位置重叠,2016-qOCA05-1和2016-qOCA05-2位置重叠,2018-qOCA03-1和2018-qOCA03-2位置重叠,2018-qOCA05-1和2018-qOCA05-2位置重叠。这些重叠的QTL位点主要集中在A03,A05和A09染色体上,并且单个QTL能够解释5.59%¹8.47%的表型变异。这些重叠位点的加性效应均为正值,说明影响含油量的增效基因主要来自于母本。2.重测序群体含油量的全基因组关联分析以重庆市油菜工程技术研究中心从国内外广泛收集的588份育种品系为材料,连续三年（2016²018）种植于重庆市北碚区歇马镇油菜种植基地（北纬29o45’39.99",东经106o22’38.47",海拔238.57 m）。利用该群体的重测序数据,筛选后得到的覆盖甘蓝型油菜基因组的385692个有效SNP数据,对连续三年含油量表型数据进行最佳线性无偏估计后（BLUP）再进行全基因组关联分析,共检测到17个与含油量显著关联的SNP位点,单个SNP位点能够解释的表型变异在5.46%⁶.68%之间,并且这些位点主要分布在A01,A03,C05和C07染色体上,其中A03染色体上包含最多的显著性位点（11个SNPs）,C07染色体上包含4个显著性位点,而A01和C05染色体上分别仅包含一个显著性位点。位于A03和C07染色体上的显著SNP位点物理位置比较相近,且位于A03染色体上的S3₁7975486位点能够解释最大的表型变异（6.68%）。3.极端含油量材料转录组测序开花后30天的种子为本地油菜油脂合成的高峰期,本研究选取了1个低油（CQ46,约33%）及2个高油（CQ24和CQ52,约43%）材料花后30天的主序种子（30SM）,主序角果皮（30SPM）,花后30天的侧枝种子（30SB）,侧枝角果皮（30SPB）进行转录组测序。结果表明,通过CQ24/CQ46和CQ52/CQ46在四个组织部位的韦恩分析发现,在30SM,30SB,30SPM和30SPB中,分别有1628,2658,2146和1493个共同差异基因;这些结果为后续筛选关键基因提供了丰富的数据。通过对CQ24/CQ46和CQ52/CQ46在四个组织部位中的共同差异基因进行GO分析发现,四个组织中差异基因富集在各生物学功能的趋势基本一致。在生物过程分类中,参与最多的GO类别是细胞过程、代谢过程和单一生物过程;在细胞组分方面,主要分布在细胞、细胞成分和细胞器;在分子功能方面主要集中在结合和催化两类别上。通过对CQ24/CQ46和CQ52/CQ46在四个组织部位中的共同差异基因进行KEGG分析发现,四个组织部位中的差异基因主要集中在代谢路径中,其中在碳代谢通路中的差异基因最多,在本研究中,我们主要关注脂质代谢路径的差异基因。在30SM,30SB,30SPM和30SPB中,分别有21,44,29和18个差异基因富集在脂质代谢路径中。4.含油量相关候选基因筛选根据要点1中对含油量进行QTL定位所获得的位点置信区间内的基因和要点2中关联分析所获得的与含油量显著关联的SNP位点上下游300kb区间内的基因,结合要点3中极端高低含油量材料转录组分析确定的差异基因,再结合拟南芥同源基因功能,筛选出可能与含油量相关的25个基因。其中12个基因在高含油量材料中是上调表达的,13个是下调表达的。为了验证转录组测序结果的准确性,我们从差异表达基因中挑选了9个基因进行qRT-PCR验证,结果显示这些差异基因在qRT-PCR和高低含油量材料转录组测序结果中的表达变化趋势相同,这充分证实了转录组测序分析结果的可靠性。5.主效BnaFAX1基因的筛选本研究通过对拟南芥中脂质转运（FAX）基因在甘蓝型油菜中的同源基因家族成员进行鉴定,发现了21个成员,同时对拟南芥,白菜,甘蓝和甘蓝型油菜中的FAX成员进行进化分析,并将甘蓝型油菜中的FAX成员的基因结构,保守模块等与拟南芥FAX成员进行对比,结果发现在6个BnaFAX1成员中,BnaFAX1-1和BnaFAX1-2在进化关系上与AtFAX1最相近,且基因结构与保守模块与AtFAX1最相似。通过比较6个BnaFAX1成员在高低含油量甘蓝型油菜不同组织部位的表达量发现:BnaFAX1-1在高含油量油菜的所有检测组织中的表达量均高于低含油量材料,BnaFAX1-2在高含油量油菜的大部分检测组织中的表达量均高于低含油量材料,BnaFAX1-3在所有检测组织中几乎不表达,BnaFAX1-4在所有检测组织中的表达水平比较低,而BnaFAX1-5和BnaFAX1-6在各检测组织中的表达水平虽然比较高,但是他们在低含油量油菜各组织中的表达水平基本都高于高含油量油菜。因此我们推测BnaFAX1-1和BnaFAX1-2在高含油量油菜的油脂积累中发挥着主要作用,过表达这两个基因也许能提高甘蓝型油菜种子的含油量。而且在我们之前利用60K SNP芯片对地上部生物产量进行GWAS分析的研究中,BnaFAX1-1（14454789-14456198）位于生物产量显著性位点Bn-A07-p12412116位置14546056上游91kb处。因此,本研究选择了BnaFAX1-1和BnaFAX1-2两个基因进行进一步的转基因研究。6.BnaFAX1-1和BnaFAX1-2基因在拟南芥中异源过表达对植株生长发育的影响通过比较野生型与异源过表达BnaFAX1-1和BnaFAX1-2的拟南芥植株生长表型,我们发现异源过表达BnaFAX1-1和BnaFAX1-2转基因植株生长更加旺盛,通过对生长49天的拟南芥进行表型统计,我们发现BnaFAX1-1和BnaFAX1-2过表达株系的茎秆鲜重（茎秆第二节间向上1cm）,茎秆直径（茎秆第二节间向上1cm处）,株高,莲座叶鲜重,莲座叶干重,地上部鲜重和地上部干重均显著高于对照。在种子成熟后,角果长度、单株角果数、每角粒数、千粒重和单株籽粒重被统计,结果显示,BnaFAX1-1过表达拟南芥单株角果数和单株籽粒重显著高于对照,而角果长度、每角粒数和千粒重并没有差异;BnaFAX1-2过表达拟南芥角果长度、单株角果数,每角粒数和单株籽粒重均显著高于对照,而千粒重并没有显著差异;以上结果表明,BnaFAX1-1和BnaFAX1-2在拟南芥中异源过表达不仅能促进植株的生长发育,而且可以提高单株籽粒产量。通过对成熟种子的总脂含量测定,我们发现BnaFAX1-1过表达拟南芥四个株系成熟种子的总脂含量均显。著高于对照,而BnaFAX1-2过表达拟南芥三个株系与对照相比并没有显著差异。7.BnaFAX1-1和BnaFAX1-2基因在甘蓝型油菜中过表达对植株生长发育的影响通过比较BnaFAX1-1和BnaFAX1-2在甘蓝型油菜中过表达株系与野生型田间花期生长表型,结果显示,与野生型甘蓝型油菜Westar相比（WT）,过表达植株表现为整株生长更加旺盛,株高更高,叶片数更多,叶片更大。为了更加准确地了解转基因植株与对照之间的生长差异,我们在每个株系中随机选择了10个单株进行表型测定。结果显示,BnaFAX1-1和BnaFAX1-2过表达株系的株高,单株主茎上的叶片数、叶长、叶宽、叶面积、茎秆上部、中部和下部的直径都显著高于对照植株（选择植株同一位置的叶片和茎秆进行测量）。而叶绿素含量和净光合速率与对照相比并没有显著差异。在田间种子成熟后,我们对BnaFAX1-1和BnaFAX1-2过表达转基因甘蓝型油菜株系与对照植株的表型进行观察与测量,调查统计显示,与对照相比,BnaFAX1-1和BnaFAX1-2转基因植株株高、有效分枝数、主花序角果数、单株角果数、角果长度、每角粒数、单株经济产量和地上部生物产量都显著高于对照,而主花序长度没有明显差异。与对照相比,BnaFAX1-1转基因种子千粒重没有显著差异,而BnaFAX1-2转基因种子千粒重则显著降低。这些结果表明,提高甘蓝型油菜中BnaFAX1-1和BnaFAX1-2基因的表达,能够有效地促进植株的生长发育,并能有效增加甘蓝型油菜的经济产量。8.BnaFAX1-1和BnaFAX1-2基因在甘蓝型油菜中过表达对种子含油量和脂肪酸成分的影响通过对BnaFAX1-1和BnaFAX1-2甘蓝型油菜过表达株系成熟种子中的含油量和蛋白含量进行测定,结果显示转基因成熟种子中的含油量均显著高于对照,而蛋白含量并没有显著差异。通过对成熟种子中脂肪酸成分的进一步分析,结果显示,与野生型对照种子相比,转基因各株系种子中油酸（C18:1）含量极显著提高,而花生酸（C20:0）和芥酸（C22:1）含量则发生极显著下降。这些结果表明BnaFAX1-1和BnaFAX1-2过表达可以同时提高种子含油量和菜籽油品质。综上所述,结果表明BnaFAX1-1在提高甘蓝型油菜籽粒含油量的同时也提高了其产量,而其在拟南芥中的同源基因并未发现类似表型。这说明BnaFAX1-1在甘蓝型油菜中具有更加重要的作用。