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刚地弓形虫是一种重要的人畜共患机会性致病原虫,在全球广泛分布,免疫力正常人群感染后呈隐性感染,但对于免疫力低下人群和妊娠期妇女危害较大。刚地弓形虫最初被认为由流行于欧洲和北美的原型克隆谱系（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）派生而来,其中Ⅰ型虫株为强毒力、非成囊株,而Ⅱ型和Ⅲ型虫株为弱/无毒力、成囊株。近年来我国研究者发现Chinese 1（ToxoDB#9）基因型为我国流行的优势基因型。尽管目前已知刚地弓形虫非成囊株为强毒株,但弓形虫不同基因型的非成囊株本身在毒力上却存在显著差异,然而对于造成这种差异的根本原因,迄今尚未完全阐明。刚地弓形虫排泄/分泌抗原（Excreted-secreted antigens,ESA）是虫体在侵袭宿主过程中释放的一类可溶性抗原成分,目前研究认为其主要蛋白组分包括微线体蛋白（Microneme proteins,MIC）、棒状体蛋白（Rhoptry proteins,ROP）和致密颗粒蛋白（Dense granule proteins,GRA）。虫体分泌的ESA除了对其顺利入侵宿主细胞至关重要,还可以诱导宿主强烈的体液及细胞免疫应答,产生抗感染免疫保护效应。然而,过强的免疫反应也可造成机体严重的免疫病理损伤。TNF-α是介导机体炎性反应的一类重要的Th1型细胞因子,以往研究已证实,弓形虫病的发病机制中也涉及TNF-α的诱导产生,并且体内和体外实验结果均表明,TNF-α是抑制弓形虫虫体增殖的重要细胞因子之一。鉴于弓形虫ESA在虫体入侵宿主细胞以及与宿主免疫系统相互作用中扮演重要角色,针对ESA的蛋白成分及其免疫学特性的靶向研究,对于阐明弓形虫非成囊株之间的毒力差异具有重要价值。本研究选择了北美和欧洲流行的典型谱系中的Type Ⅰ基因型标准强毒株RH株和流行于我国的优势基因型Chinese 1（ToxoDB#9）的强毒株TgCtwh3株作为研究对象。获得如下主要结果:1.RH株和TgCtwh3株在诱导机体分泌TNF-α和巨噬细胞向M1型极化方面具有显著差异。我们发现,两虫株速殖子体内感染和ESA体外刺激均可诱导TNF-α的产生,并且RH株诱导的TNF-α分泌水平高于TgCtwh3株。用两虫株ESA分别体外刺激原代腹腔巨噬细胞,均发现培养上清中TNF-α水平增高,且RH株ESA诱导的TNF-α水平更高。qPCR结果显示,RH株ESA可诱导原代腹腔巨噬细胞iNOS和IL-6表达水平显著上调,显示向以M1为主的方向极化,而TgCtwh3株ESA无此效应。2.利用定量iTRAQ-LC-MS/MS蛋白组学技术筛选RH株和TgCtwh3株ESA中的差异蛋白,并用Gene Ontology（GO）分析对差异蛋白进行功能注释。我们成功筛选出27个来自虫体表面和分泌细胞器的高丰度差异蛋白,其中包括11个微线体蛋白（MICs）,7个棒状体蛋白（ROPs）,3个致密颗粒蛋白（GRAs）和6个表面蛋白（SRSs）。其中有24个蛋白在RH株ESA中的表达量高于TgCtwh3株ESA。GO分析表明,相较于TgCtwh3株,这些在RH株ESA中高表达的微线体蛋白、棒状体蛋白、致密颗粒蛋白和表面蛋白,主要参与弓形虫速殖子黏附、侵袭细胞的过程,并且与两虫株毒力差异有关。通过差异表达蛋白的蛋白间相关性分析,我们发现了14种与其它蛋白质高度相关的分泌蛋白,包括6个微线体蛋白、3个棒状体蛋白和4个表面蛋白以及GRA12。3.候选蛋白的转录组验证。我们从差异蛋白中选取了5个在RH株中高表达,且与TgCtwh3株的丰度差异在3倍以上,同时具有2个以上特有肽段序列的蛋白作为候选蛋白。对这5个候选蛋白在两虫株的mRNA表达情况进行了转录水平验证。qPCR结果与iTRAQ结果一致,说明这些蛋白的差异性表达是转录水平上基因调控的结果。4.两虫株差异蛋白MIC3可诱导机体分泌TNF-α。在两虫株ESA差异蛋白中,我们选取一个较为感兴趣的重要节点蛋白——MIC3,发现该蛋白可以体外刺激诱导机体分泌产生TNF-α,并且呈浓度梯度依赖效应。高剂量的MIC3蛋白还可诱导巨噬细胞向M1方向极化。本研究结果从一个新的角度揭示了 MIC3的蛋白功能,即MIC3不仅在弓形虫入侵宿主过程中发挥重要作用,同时还可以刺激机体免疫系统产生TNF-α效应。