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利用肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,C.pn)体外感染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞模型,观察C.pn感染对血管内皮细胞(Vascular endothelial cell,VEC)通透性的影响,并从血管内皮细胞钙粘素(Vascular endothelial cadherin,VE cadherin)内吞的角度探讨C.pn感染增加VEC通透性的机制,证实C.pn感染可通过促使VE钙粘素磷酸化促进VE钙粘素内吞而增加VEC通透性。方法:1.免疫荧光法检测VEC生长致密时的细胞间连接;2.测量累计荧光透过率检测C.pn感染对VEC通透性的影响;3.CCK-8实验检测氯喹在作用时间和工作浓度内对VEC的毒性;4.用氯喹处理VEC后,采用免疫荧光法观察C.pn感染后对VE钙粘素内吞的影响;5.CCK-8实验检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在作用时间和工作浓度内对VEC的毒性;6.应用Western blot实验检测C.pn感染VEC后VE钙粘素总蛋白表达水平的变化;7.利用质膜提取试剂盒提取VEC细胞膜蛋白或以胰酶去除细胞膜后提取VEC胞浆蛋白,应用Western blot实验观察C.pn感染后VE钙粘素的内吞情况;8.CCK-8实验检测内吞抑制剂氯丙嗪在作用时间和工作浓度内对VEC的毒性;9.测量累计荧光透过率检测加入氯丙嗪后,C.pn感染对VEC通透性的影响;10.CCK-8实验检测缓激肽在作用时间和浓度内对VEC的毒性;11.应用Western blot实验检测Src激酶抑制剂PP2对C.pn感染促进VE钙粘素Y658位点磷酸化的影响;12.测量累计荧光透过率观察PP2对C.pn感染增加VEC通透性的影响;13.利用质膜提取试剂盒提取VEC细胞膜蛋白或以胰酶去除细胞膜后提取VEC胞浆蛋白,应用Western blot实验检测PP2对C.pn感染促进VE钙粘素内吞的影响。结果:1.光学显微镜下可见,生长致密的VEC细胞间连接完整;2.C.pn感染VEC 0 h、18 h、24 h、36 h、48 h后,VEC通透性明显增高,其中以感染24 h后增高最为明显,差异具有统计学意义(P<0.05);3.CCK-8实验结果显示,以20μmol/l、40μmol/l、60μmol/l和80μmol/l工作浓度的氯喹处理VEC 24 h对VEC活力无明显影响,差异无统计学意义,而以100μmol/l的氯喹处理VEC 24 h后,VEC活力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);4.激光共聚焦结果显示,正常VEC内呈特征性荧光绿色的VE钙粘素均匀分布于细胞与细胞连接处。C.pn感染24 h后,VE钙粘素在VEC胞膜处表达明显减少,但在胞浆中表达增多,且呈弥散分布,细胞间连接不再清晰分明,并出现明显缝隙。而氯喹处理后,C.pn感染引起的VE钙粘素由胞膜向胞浆内分布即VE钙粘素内吞更为明显。5.CCK-8实验结果显示,在工作时间内,工作浓度的VEGF对VEC活力无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05);6.Western blot结果显示:C.pn感染组、VEGF组、C.pn感染+氯喹处理组、VEGF+氯喹处理组以及氯喹处理组与正常对照组相比,VE钙粘素总蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05);7.Western blot结果显示:C.pn感染组和VEGF处理组的细胞膜VE钙粘素表达水平与正常对照组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),而正常对照组细胞浆中仅能检测到少量的VE钙粘素,C.pn感染组与VEGF处理组的细胞浆中VE钙粘素较正常对照组有所增加;应用溶酶体抑制剂氯喹抑制内吞的VE钙粘素降解后,C.pn感染+氯喹处理组与C.pn感染组相比,其细胞膜上VE钙粘素表达水平无明显差异,但前者细胞浆中VE钙粘素表达水平较后者有所增加,差异具有统计学意义(P<0.05);VEGF+氯喹处理组与VEGF处理组的VEC细胞膜上VE钙粘素表达水平无明显增加,但与后者相比,前者细胞浆中VE钙粘素表达水平明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),提示C.pn感染可明显促进VE钙粘素内吞。8.CCK-8实验结果显示,在工作时间内,工作浓度的氯丙嗪对VEC活力无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05);9.通过测量累计荧光透过率发现,加入氯丙嗪抑制VE钙粘素内吞后,C.pn感染引起的VEC通透性增加被明显抑制(P<0.05);10.CCK-8实验结果显示,在工作时间内,工作浓度的缓激肽对VEC活力无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05);11.Western blot结果显示:C.pn感染组和缓激肽处理组VE钙粘素磷酸化水平较正常对照组显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);PP2+C.pn感染组的VE钙粘素磷酸化水平较C.pn感染组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);12.累计荧光透过率检测结果显示,PP2预处理可削弱缓激肽促进VEC通透性增加的作用,差异具有统计学意义(P<0.05);同时,PP2预处理VEC后,C.pn感染增加VEC通透性的作用也明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05),提示C.pn感染可通过促进VE钙粘素磷酸化而增加VEC通透性;13.Western blot结果显示,C.pn感染组和缓激肽处理组的细胞膜VE钙粘素磷酸化水平与与正常对照组相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而PP2+C.pn感染组的VE钙粘素磷酸化水平较C.pn感染组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);且在细胞浆中,C.pn感染组和缓激肽处理组的VE钙粘素磷酸化水平较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);C.pn感染+氯喹处理组的VE钙粘素Y658位点的酪氨酸磷酸化水平较C.pn感染组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:C.pn感染可能通过促进VE钙粘素Y658位点的磷酸化促进VE钙粘素内吞,进而增加VEC通透性。